| 本文创新性研究工作 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| 英文摘要 | 第14-16页 |
| 缩略词 | 第16-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-38页 |
| 第一章 小鹅瘟的研究进展 | 第17-28页 |
| 1 小鹅瘟病毒的病原学特征 | 第17-20页 |
| ·小鹅瘟病毒的理化特征 | 第17-18页 |
| ·小鹅瘟病毒的宿主范围和培养特性 | 第18页 |
| ·基因组分子生物学 | 第18-20页 |
| ·蛋白质分子生物学 | 第20页 |
| 2 流行病学 | 第20-21页 |
| 3 临床症状和病理变化 | 第21-23页 |
| ·肠道变化 | 第22-23页 |
| ·其他组织器官的变化 | 第23页 |
| 4 小鹅瘟诊断方法 | 第23-25页 |
| 5 小鹅瘟病毒的基因克隆以及体外编码蛋白的研究 | 第25-26页 |
| 6 综合防制 | 第26-27页 |
| 7 研究展望 | 第27-28页 |
| 第二章 增强基因疫苗免疫效果的策略 | 第28-38页 |
| 1 基因疫苗的免疫学优势和所存在的问题 | 第28-31页 |
| ·基因疫苗的免疫学优势 | 第28-30页 |
| ·诱导全方位的免疫应答 | 第28-29页 |
| ·不同血清亚型的交叉免疫 | 第29页 |
| ·嵌合免疫、多重免疫及联合免疫 | 第29页 |
| ·长期免疫 | 第29-30页 |
| ·性质稳定,安全性好,受母源抗体影响小 | 第30页 |
| ·制约基因疫苗免疫效果的因素 | 第30-31页 |
| ·依赖宿主产生抗原 | 第30页 |
| ·宿主细胞内外屏障 | 第30-31页 |
| ·抗原表达量低 | 第31页 |
| 2 增强基因疫苗免疫效果的一些策略 | 第31-38页 |
| ·基因疫苗质粒的优化 | 第31-33页 |
| ·选择强的转录启动子 | 第31页 |
| ·注意密码子的偏嗜 | 第31-32页 |
| ·构建双向或双顺反子质粒 | 第32页 |
| ·载体中的免疫刺激性序列(ISS) | 第32-33页 |
| ·其它元件 | 第33页 |
| ·免疫接种系统和途径的选择 | 第33-34页 |
| ·接种方法 | 第33页 |
| ·接种途径 | 第33页 |
| ·免疫动物的预处理 | 第33-34页 |
| ·克服细胞内、外屏障 | 第34-35页 |
| ·使用脂质体、亚精胺和核酸酶抑制剂 | 第34页 |
| ·抗原蛋白的泛素化表达 | 第34页 |
| ·内质网转运信号序列 | 第34-35页 |
| ·基因疫苗的细菌传送系统 | 第35页 |
| ·优化免疫应答趋向类型 | 第35-38页 |
| ·和细胞因子共表达 | 第35-36页 |
| ·共刺激信号分子 | 第36-37页 |
| ·初次免疫和加强免疫使用相同抗原的不同类型的疫苗 | 第37-38页 |
| 第二部分 实验研究 | 第38-137页 |
| 第三章 小鹅瘟病毒VP3基因的克隆和分子特性研究 | 第38-58页 |
| 1 材料 | 第38-40页 |
| ·病毒及核酸 | 第38页 |
| ·试验动物和鹅胚 | 第38-39页 |
| ·质粒与感受态细胞 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器设备 | 第39-40页 |
| 2 方法 | 第40-46页 |
| ·GPV CHv-1强毒株的增殖 | 第40页 |
| ·病毒基因组DNA的提取 | 第40-41页 |
| ·引物设计 | 第41页 |
| ·VP3基因的PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·PCR产物的凝胶试剂盒回收和纯化 | 第42页 |
| ·大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| ·VP3基因加A尾以及与T载体的连接 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的转化 | 第44页 |
| ·碱裂解法小量抽提重组质粒 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定 | 第45页 |
| ·VP3基因序列测定 | 第45页 |
| ·VP3基因及推导蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测 | 第45-46页 |
| 3 结果 | 第46-56页 |
| ·PCR结果 | 第46页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第46-47页 |
| ·CHv-1株VP3基因测序结果及其与标准株的比较分析 | 第47-50页 |
| ·GPV VP3基因的遗传特点 | 第50-51页 |
| ·GPV CHv-1 VP3基因推导蛋白质二级结构预测结果 | 第51-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| ·关于GPV VP3基因的PCR扩增 | 第56页 |
| ·GPV CHv-1株VP3基因的序列测定和结果分析 | 第56-57页 |
| ·GPV VP3基因用于构建基因疫苗的可行性 | 第57页 |
| 5 小结 | 第57-58页 |
| 第四章 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其在真核细胞的表达 | 第58-69页 |
| 1 材料 | 第58-60页 |
| ·菌株及质粒 | 第58-59页 |
| ·毒株、细胞及鸭胚 | 第59页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·主要仪器 | 第59-60页 |
| 2 方法 | 第60-64页 |
| ·T载体的酶切和VP3基因片段的纯化回收 | 第60-61页 |
| ·真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切和线性化 | 第61-62页 |
| ·VP3基因回收片段和线性化pcDNA3.1(+)的连接(亚克隆) | 第62页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第62页 |
| ·真核重组表达载体的转化 | 第62页 |
| ·阳性重组真核表达质粒的小量抽提和鉴定 | 第62页 |
| ·GPV病毒提纯及兔抗GPV多克隆抗体的制备 | 第62-63页 |
| ·pcDNA-VP3转染COS-7真核细胞 | 第63-64页 |
| ·间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-VP3在真核细胞的瞬时表达 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-66页 |
| ·VP3基因的亚克隆 | 第64-65页 |
| ·兔抗GPV IgG的纯化结果 | 第65-66页 |
| ·真核表达质粒在COS-7细胞上的瞬时表达 | 第66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| ·构建小鹅瘟基因疫苗的必要性 | 第66-67页 |
| ·构建基因疫苗的一些影响因素 | 第67-68页 |
| ·GPV VP3基因疫苗在真核细胞的表达 | 第68页 |
| 5 小结 | 第68-69页 |
| 第五章 串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3融合基因DNA疫苗的构建 | 第69-91页 |
| 1 材料 | 第69-70页 |
| ·实验动物 | 第69页 |
| ·菌株和质粒 | 第69-70页 |
| ·主要试剂 | 第70页 |
| ·主要仪器 | 第70页 |
| 2 方法 | 第70-77页 |
| ·重叠延伸引物的设计 | 第70-71页 |
| ·碱裂解法小量抽提pMD18T-gIL2和pMD18T-VP3 | 第71页 |
| ·gIL-2基因的PCR扩增 | 第71-72页 |
| ·VP3基因的PCR扩增 | 第72-73页 |
| ·gIL-2和VP3基因PCR产物的回收和纯化 | 第73页 |
| ·gIL2-VP3融合基因的SOE PCR扩增 | 第73-74页 |
| ·融合基因PCR产物的纯化和回收 | 第74页 |
| ·克隆至pMD18T-Simple载体和转化受体菌 | 第74页 |
| ·融合基因gIL2-VP3的亚克隆 | 第74-75页 |
| ·融合基因真核表达载体的鉴定 | 第75页 |
| ·融合蛋白的生物信息学分析 | 第75-76页 |
| ·间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞上的表达 | 第76页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 | 第76-77页 |
| 3 结果 | 第77-86页 |
| ·gIL2-Linker的初次PCR结果 | 第77页 |
| ·GPV的Linker-VP3初次PCR结果 | 第77-78页 |
| ·gIL2-VP3融合基因的PCR结果 | 第78-79页 |
| ·融合基因的T载体克隆和测序结果 | 第79-80页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3真核表达载体的构建结果 | 第80-83页 |
| ·gIL2-VP3融合基因的生物信息学分析 | 第83页 |
| ·间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞中的表达 | 第83-86页 |
| ·表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 | 第86页 |
| 4 讨论 | 第86-90页 |
| ·关于鹅白介素-2(gIL-2)的佐剂效应 | 第87-88页 |
| ·关于重叠延伸PCR | 第88-89页 |
| ·融合基因gIL2-VP3的分子结构特点 | 第89页 |
| ·gIL-2信号肽引导的分泌表达 | 第89-90页 |
| 5 小结 | 第90-91页 |
| 第六章 CpG序列嵌入串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗中的构建 | 第91-102页 |
| 1 材料 | 第91-92页 |
| ·菌株和质粒 | 第91页 |
| ·主要试剂 | 第91-92页 |
| ·主要仪器 | 第92页 |
| 2 方法 | 第92-95页 |
| ·CpG的合成及T载体克隆 | 第92页 |
| ·pMD18 T-CpG的酶切和回收 | 第92-93页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3的酶切和回收 | 第93页 |
| ·CpG和线性pcDNA-gIL2-VP3的连接 | 第93-94页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第94页 |
| ·连接产物的转化 | 第94页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3/CpG重组质粒的筛选 | 第94-95页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3/CpG真核表达质粒在真核细胞的表达 | 第95页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3/CpG对鹅外周血淋巴细胞的免疫刺激作用 | 第95页 |
| 3 结果 | 第95-99页 |
| ·pMD18 T-CpG的测序结果 | 第95-96页 |
| ·pMD18T-CpG的酶切鉴定 | 第96页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3/CpG的构建及其鉴定 | 第96-97页 |
| ·间接免疫荧光抗体试验检测pcDNA-gIL2-VP3/CpG在真核细胞的表达 | 第97-99页 |
| ·CpG序列对鹅外周血淋巴细胞的增殖效应 | 第99页 |
| 4 讨论 | 第99-101页 |
| ·关于CpG ODN的设计和嵌入质粒的构建 | 第99-100页 |
| ·CpG序列的免疫佐剂效应 | 第100-101页 |
| 5 小结 | 第101-102页 |
| 第七章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅细胞免疫的比较研究 | 第102-115页 |
| 1 材料 | 第102-103页 |
| ·菌种和质粒 | 第102页 |
| ·试验动物 | 第102页 |
| ·主要试剂 | 第102-103页 |
| ·主要仪器 | 第103页 |
| 2 方法 | 第103-106页 |
| ·基因疫苗的大量制备 | 第103-104页 |
| ·聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗质粒 | 第104-105页 |
| ·雏鹅的分组免疫及血样采集 | 第105-106页 |
| ·鹅外周血(PBMC)淋巴细胞增殖试验(MTT法) | 第106页 |
| ·外周血淋巴细胞的分离 | 第106页 |
| ·淋巴细胞的诱导培养 | 第106页 |
| ·样品检测及数据处理 | 第106页 |
| 3 结果 | 第106-111页 |
| ·基因疫苗免疫动物后健康状况 | 第106页 |
| ·鹅免疫GPV VP3基因疫苗后淋巴细胞增殖试验检测结果 | 第106-107页 |
| ·pcDNA-VP3基因疫苗免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 | 第107页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP3免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 | 第107-109页 |
| ·pcDNA-gIL2-VP2/CpG免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 | 第109-110页 |
| ·GPV VP3基因疫苗免疫鹅后外周淋巴血细胞增殖试验结果 | 第110-111页 |
| 4 讨论 | 第111-114页 |
| ·细胞免疫对于防治感染性疾病的重要性 | 第111-112页 |
| ·细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 | 第112页 |
| ·分子免疫佐剂对基因疫苗诱导的细胞免疫反应的影响 | 第112-113页 |
| ·免疫途径、剂量对细胞免疫的影响 | 第113-114页 |
| 5 小结 | 第114-115页 |
| 第八章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体液免疫的比较研究 | 第115-137页 |
| 1 材料 | 第115-116页 |
| ·毒株、质粒及疫苗 | 第115页 |
| ·试验动物 | 第115页 |
| ·主要试剂 | 第115-116页 |
| ·主要仪器 | 第116页 |
| 2 方法 | 第116-120页 |
| ·鹅血清IgG的纯化 | 第116-117页 |
| ·兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 | 第117页 |
| ·间接ELISA的操作方法 | 第117-118页 |
| ·抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 | 第118页 |
| ·酶标抗体稀释度的选择 | 第118页 |
| ·GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清IgG水平的检测 | 第118-119页 |
| ·GPV CHa弱毒株TCID_(50)的测定 | 第119页 |
| ·GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清中和抗体水平的检测 | 第119页 |
| ·种鹅的分组免疫及所产蛋卵黄ELISA抗体和中和抗体的检测 | 第119-120页 |
| ·免疫种鹅所产蛋孵出的小鹅攻毒保护试验 | 第120页 |
| 3 结果 | 第120-133页 |
| ·兔抗鹅HRP酶标抗体的制备 | 第120-122页 |
| ·抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 | 第122-123页 |
| ·HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 | 第123页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后的IgG动态变化结果 | 第123页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-VP3后IgG动态变化 | 第123-125页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗后IgG动态变化 | 第125页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗后IgG动态变化 | 第125-126页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后IgG动态变化结果 | 第126-128页 |
| ·病毒TCID_(50)的测定 | 第128页 |
| ·鹅基因免疫后血清中和抗体试验检测结果 | 第128-129页 |
| ·母鹅卵黄抗体ELISA检测结果和中和抗体试验结果 | 第129-132页 |
| ·雏鹅攻毒保护试验结果 | 第132-133页 |
| 4 讨论 | 第133-136页 |
| ·ELISA标准方法的建立 | 第133页 |
| ·关于GPV VP3基因疫苗诱导的体液免疫 | 第133-134页 |
| ·免疫佐剂对体液免疫的影响 | 第134-136页 |
| ·雏鹅攻毒保护试验 | 第136页 |
| 5 小结 | 第136-137页 |
| 第三部分 结论 | 第137-138页 |
| 第四部分 参考文献 | 第138-154页 |
| 第五部分 附件材料 | 第154-167页 |
| 附录一 主要溶液试剂的配制 | 第154-158页 |
| 附录二 雏鹅攻毒保护试验中发病鹅的主要临床症状和病变 | 第158-160页 |
| 附录三 测序报告 | 第160-167页 |
| 1.pMD18T-VP3测序结果 | 第160-163页 |
| 2.pMD18T-gIL2-VP3测序结果 | 第163-166页 |
| 3.pMD18T-CpG测序结果 | 第166-167页 |
| 致谢 | 第167-168页 |
| 作者简介 | 第168页 |
