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雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究

本论文的创新性工作第1-8页
中文摘要第8-12页
ABSTRACT第12-17页
缩略词表第17-33页
第一部分 文献综述第33-61页
 第一章 禽腺病毒的研究进展第33-51页
  1 腺病毒的概况第33-36页
   ·腺病毒的分类第33页
   ·腺病毒的特点第33-35页
   ·腺病毒的感染及复制第35-36页
  2 禽腺病毒的概况第36-44页
   ·禽腺病毒的分类第37-39页
     ·Ⅰ群禽腺病毒第37-38页
     ·Ⅱ群禽腺病毒第38-39页
     ·Ⅲ群禽腺病毒第39页
   ·禽腺病毒的形态结构及形态发生特点第39-40页
   ·禽腺病毒的浮力密度第40-41页
   ·禽腺病毒的体外培养第41页
   ·禽腺病毒的致病机理第41-42页
   ·禽腺病毒的诊断方法第42-43页
   ·腺病毒感染第43-44页
     ·鹅的疑是腺病毒性肝炎第43页
     ·鹅的腺病毒感染第43-44页
  3 雏鹅新型病毒性肠炎的研究概况第44-51页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎概述第44-45页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎病毒病原学第45页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎流行情况第45页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎临床症状第45-46页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎病理变化第46-47页
     ·眼观变化第46页
     ·组织学变化第46-47页
   ·雏鹅新型病毒性肠炎实验室诊断第47-48页
     ·病毒的分离和鉴定第47页
     ·电镜检测技术第47页
     ·血清学诊断第47-48页
   ·防治措施第48-51页
     ·疫苗免疫第48页
     ·高免血清防治第48页
     ·不从疫区引进雏鹅和种鹅第48-49页
     ·加强饲养管理第49-51页
 第二章 腺病毒感染与宿主细胞凋亡研究进展第51-61页
  1 细胞凋亡概况第51-52页
  2 病毒感染与细胞凋亡关系第52-54页
  3 腺病毒诱导细胞凋亡的发现第54-55页
  4 腺病毒感染与细胞凋亡的作用机制第55-59页
   ·EIA第56-57页
   ·EIB第57-58页
     ·E1B-19K第57-58页
     ·E1B-55K第58页
   ·E3第58-59页
     ·E3区域编码的三个蛋白对细胞凋亡的阻遏作用第58页
     ·E3区域编码的ADP蛋白的致细胞凋亡作用第58-59页
   ·E4第59页
     ·E4-ORF6第59页
     ·E4-ORF4第59页
  5 结语第59-61页
第二部分 实验研究第61-229页
 第三章 NGVEV-CN强毒在感染鸭胚体内的形态发生学以及宿主细胞超微病理学研究第61-75页
  1 材料第61-63页
   ·毒株第61页
   ·试验鸭胚第61页
   ·主要试剂及配制第61-62页
   ·主要仪器及设备第62-63页
   ·器材第63页
  2 方法第63-64页
   ·NGVEV适应鸭胚第63页
   ·鸭胚的人工感染NGVEV试验第63页
   ·透射电镜样品制备及观察第63-64页
     ·透射电镜样品的制备具体步骤操作第63-64页
     ·超薄切片和染色第64页
     ·透射电镜观察和记录第64页
  3 结果第64-72页
   ·NGVEV在鸭胚中的传代情况第64页
   ·感染鸭胚眼观病理变化及电镜下NGVEV颗粒的形态特征第64-65页
   ·NGVEV病毒粒子在感染鸭胚体内的分布及其形态发生特点第65-66页
   ·感染鸭胚宿主的超微结构变化第66-72页
     ·尿囊膜第66-68页
     ·肝第68-69页
     ·肌胃第69页
     ·肠道第69-71页
     ·心第71页
     ·脑第71-72页
  4 讨论第72-74页
   ·NGVEV鹅胚尿囊液在鸭胚的适应第72页
   ·NGVEV病毒粒子在感染鸭胚中的形态特征和形态发生过程第72页
   ·NGVEV感染鸭胚的主要靶器官和靶细胞器第72-73页
   ·人工感染NGVEV雏鹅和鸭胚的宿主细胞超微结构病变的比较第73-74页
  5 小结第74-75页
 第四章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株适应鸭胚成纤维细胞及其体外培养的增殖特性研究第75-85页
  1 材料第75-76页
   ·毒株第75页
   ·试验鸭胚第75页
   ·主要试剂及配制第75-76页
   ·主要仪器及设备第76页
   ·器材第76页
  2 方法第76-78页
   ·单层鸭胚成纤维细胞的制备第76-77页
   ·NGVEV在原代鸭胚成纤维细胞上的适应第77页
   ·NGVEV-CN细胞毒在DEF上增殖研究第77-78页
     ·不同代次NGVEV细胞毒的病毒滴度测定第77页
     ·F_5代NGVEV细胞毒在不同感染时间的病毒滴度测定第77-78页
  3 结果第78-82页
   ·NGVE-CN在原代鸭胚成纤维细胞上的适应情况第78-80页
   ·NGVEV-CN细胞毒在DEF细胞的增殖情况第80-81页
     ·不同传代次数的NGVE-CN细胞毒的TCID_(50)测定第80页
     ·F_5代不同感染时间点的NGVEV-CN细胞毒TCID_(50)测定第80-81页
   ·被NGVEV感染的DEF细胞的细胞病变特征第81-82页
  4 讨论第82-84页
   ·NGVEV对DEF细胞的适应第82-83页
   ·NGVEV-CN细胞毒的释放第83页
   ·NGVEV在DEF细胞的增殖规律第83-84页
  5 小结第84-85页
 第五章 NGVEV-CN强毒株在鸭胚成纤维细胞上的形态发生学和宿主细胞超微结构病变研究第85-97页
  1 材料第85-86页
   ·毒株第85页
   ·试验鸭胚第85页
   ·主要试剂及配制第85页
     ·细胞培养相关试剂第85页
     ·透射电子显微镜观察样品制备相关试剂第85页
   ·主要仪器及设备第85-86页
  2 方法第86-87页
   ·原代单层鸭胚成纤维细胞的制备第86页
   ·NGVEV感染DEF细胞及采样第86页
   ·透射电镜样品准备及操作方法第86-87页
     ·透射电镜样品制备的具体步骤第86页
     ·超薄切片和染色第86页
     ·观察和记录第86-87页
  3 结果第87-93页
   ·电镜下NGVEV病毒粒子的确认和形态特征第87页
   ·NGVEV在感染细胞内的形态发生过程第87-88页
   ·NGVEV的胞浆包涵体结构第88页
   ·被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构变化第88-92页
     ·线粒体的固缩变化第88-89页
     ·细胞浆中不规则的电子致密物质第89-91页
     ·细胞浆的粗面内质网扩张第91-92页
     ·细胞浆内空泡的形成第92页
   ·NGVEV致DEF细胞凋亡现象第92-93页
  4 讨论第93-95页
   ·NGVEV在DEF细胞中的形态特征和形态发生过程第93-94页
   ·NGVEV的胞浆包涵体结构第94页
   ·NGVEV致DEF细胞线粒体的固缩和异常聚集变化第94-95页
  5 小结第95-97页
 第六章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致鸭胚成纤维细胞凋亡的相关研究第97-115页
  1 材料第97-100页
   ·毒株第97-98页
   ·试验鸭胚第98页
   ·主要试剂及配制第98-99页
     ·细胞培养相关试剂第98页
     ·光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂第98页
     ·透射电子显微镜观察细胞凋亡的相关试剂第98页
     ·DNA提取及电泳试剂第98-99页
     ·Annexin V-FITC/PI双标记试剂盒第99页
   ·主要仪器及设备第99页
   ·器材第99-100页
  2 方法第100-102页
   ·鸭胚成纤维细胞体外培养第100页
   ·光学显微镜观察第100页
   ·透射电镜观察第100-101页
     ·制样第100页
     ·超薄切片和染色第100页
     ·观察和记录第100-101页
   ·琼脂糖凝胶电泳检测第101页
   ·Annexin V-FITC/PI双标记的流式细胞仪检测第101页
   ·Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察第101-102页
  3 结果第102-110页
   ·HE染色法的光镜观察第102-103页
   ·透射电子显微镜观察第103-105页
   ·琼脂糖凝胶电泳检测第105页
   ·Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测第105-108页
   ·Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察第108-110页
  4 讨论第110-112页
   ·NGVEV致DEF细胞凋亡第110-111页
   ·NGVEV致DEF细胞凋亡的形态学观察第111页
   ·细胞凋亡与细胞病变的关系第111-112页
   ·NGVEV致DEF细胞凋亡的意义第112页
  5 小结第112-115页
 第七章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、负染超微结构观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备第115-131页
  1 材料第115-118页
   ·毒株第115页
   ·试验鸭胚第115页
   ·主要试剂及配制第115-117页
     ·细胞培养相关试剂第115页
     ·CsCl密度梯度离心相关试剂配制第115页
     ·负染电镜相关试剂第115-116页
     ·SDS-PAGE试剂的配制第116-117页
     ·马斯亮兰染色的配制第117页
     ·琼脂板的制备第117页
     ·抗原制备及抗体纯化的相关试剂第117页
   ·主要仪器及设备第117-118页
   ·器材第118页
  2 方法第118-121页
   ·病毒增殖第118页
     ·经鸭胚尿囊腔增殖第118页
     ·经体外培养的鸭胚成纤维细胞增殖第118页
   ·NGVEV的提纯方法第118-119页
     ·沉淀法纯化病毒第118页
     ·差速离心法纯化病毒第118页
     ·CsCl密度梯度和等密度超速离心纯化病毒第118-119页
   ·应用透射电镜对NGVEV超微结构进行负染观察第119页
   ·兔抗NGVEV高免血清的制备第119-121页
     ·病毒蛋白含量的测定(Bradford法)第119-120页
     ·差速离心法纯化病毒第120页
     ·NGVEV免疫抗原的制备第120页
     ·抗体效价的检测第120页
     ·兔抗NGVEV血清IgG的提取和纯化第120-121页
     ·兔抗NGVEV血清IgG蛋白含量的测定第121页
     ·兔抗NGVEV血清IgG纯度的检测第121页
  3 结果第121-128页
   ·NGVEV在鸭胚及DEF细胞的增殖情况第121-122页
   ·不同纯化方法的结果第122-126页
     ·沉淀法纯化病毒第122页
     ·差速离心法纯化病毒第122页
     ·CsCl不连续密度梯度和等密度超速离心纯化病毒第122-126页
   ·兔抗NGVEV高免血清的制备第126-128页
     ·免疫兔子的抗原的浓度第126页
     ·抗体效价检测第126页
     ·兔抗NGVEV血清IgG的纯化第126-128页
  4 讨论第128-130页
   ·关于NGVEV的提纯第128-129页
   ·完整NGVEV粒子与不完整NGVEV粒子第129页
   ·兔抗NGVEV高免血清IgG的纯化第129-130页
  5 小结第130-131页
 第八章 利用免疫组化SP法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究第131-155页
  1 材料第131-133页
   ·毒株第131页
   ·试验动物第131-132页
   ·主要试剂及配制第132页
     ·组织固定液第132页
     ·脱水剂第132页
     ·组织包埋剂第132页
     ·APES粘片剂第132页
     ·苏木素染染色剂第132页
     ·免疫组化染色试剂第132页
   ·主要仪器及设备第132-133页
   ·器材第133页
  2 方法第133-137页
   ·NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备第133页
   ·病理模型的构建第133-134页
   ·人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集第134页
   ·载玻片和盖玻片的处理第134页
   ·免疫组化检测材料的固定、包埋和切片第134-135页
   ·免疫组化检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化第135-137页
     ·免疫组化SP法检测NGVEV方法的条件优化第135页
     ·特异性试验第135-136页
     ·重复性和稳定性实验第136页
     ·免疫组化SP法染色程序第136页
     ·结果的判定第136-137页
  3 结果第137-151页
   ·雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的临床症状第137页
   ·雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的大体病变第137-139页
   ·免疫组化SP染色方法的建立和优化第139-140页
   ·特异性实验结果第140页
   ·重复性和稳定性实验结果第140-141页
   ·应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在感染鹅各组织中的定位及动态分布第141-150页
     ·NGVEV在感染雏鹅的免疫器官的定位及动态分布第142-145页
     ·NGVEV在感染雏鹅的消化器官的定位及动态分布第145-149页
     ·NGVEV在感染雏鹅的其他器官的定位及动态分布第149-150页
   ·应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布第150-151页
  4 讨论第151-154页
   ·免疫组织化学染色法检测NGVEV的建立与优化第151-152页
   ·NGVEV侵染鹅免疫器官的意义第152-153页
   ·NGVEV侵染鹅消化器官的意义第153-154页
  5 小结第154-155页
 第九章 利用免疫荧光抗体法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究第155-175页
  1 材料第155-156页
   ·毒株第155页
   ·试验动物第155页
   ·主要试剂及配制第155-156页
     ·免疫荧光染色试剂第155-156页
     ·称染试剂第156页
     ·其余试剂第156页
   ·主要仪器及设备第156页
  2 方法第156-158页
   ·NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备第156页
   ·病理模型的构建第156页
   ·人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集第156页
   ·载玻片和盖玻片的处理第156页
   ·间接免疫荧光检测材料的固定、包埋和切片第156页
   ·间接免疫荧光检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化第156-158页
     ·间接免疫荧光检测NGVEV条件的优化第156-157页
     ·特异性试验第157-158页
     ·间接免疫荧光法检测石蜡切片中NGVEV的染色程序第158页
     ·免疫荧光染色结果判定第158页
  3 结果第158-169页
   ·免疫荧光染色方法的建立和优化结果第158-160页
   ·特异性实验结果第160页
   ·应用间接免疫荧光检测NGVEV在感染鹅组织中的定位及动态分布第160-168页
   ·应用间接免疫荧光检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布第168-169页
  4 讨论第169-172页
   ·关于荧光抗体技术的应用和优化第169-171页
   ·免疫荧光法和免疫组化SP法检测NGVEV的比较第171页
   ·NGVEV的组织嗜性及分布规律第171-172页
   ·其他腺病毒的感染和组织嗜性第172页
  5 小结第172-175页
 第十章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究第175-197页
  1 材料第175-177页
   ·毒株第175页
   ·试验动物第175页
   ·主要试剂及配制第175-177页
     ·光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂第175-176页
     ·透射电子显微镜观察细胞凋亡的试剂第176页
     ·DNA提取及电泳试剂第176页
     ·TUNEL法检测相关试剂第176-177页
     ·其它常规试剂第177页
   ·主要仪器及设备第177页
   ·器材第177页
  2 方法第177-180页
   ·试验鹅的人工感染及组织样品的采集第177-178页
   ·HE染色的光学显微镜观察第178-179页
   ·透射电子显微镜观察第179页
   ·琼脂糖凝胶电泳检测宿主细胞DNA Ladder第179页
   ·TUNEL法检测细胞凋亡第179-180页
  3 结果第180-192页
   ·HE染色的可见光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化第180-181页
   ·透射电子显微镜观察凋亡细胞的超微形态学变化第181-187页
   ·DNA Ladder检测第187-188页
   ·TUNEL法检测第188-192页
  4 讨论第192-195页
   ·细胞凋亡的检测方法第192-194页
   ·NGVEV感染与宿主鹅的细胞凋亡第194-195页
  5 小结第195-197页
 第十一章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GOIL-2对疫苗的佐剂效应研究第197-217页
  1 材料第197-199页
   ·毒株及佐剂第197页
   ·试验青年鹅及鸭胚第197页
   ·主要试剂及配制第197-198页
     ·MTT相关溶液的配制第197-198页
     ·ELISA相关溶液的配制第198页
     ·中和实验相关试剂第198页
   ·主要仪器及设备第198-199页
   ·器材第199页
  2 方法第199-202页
   ·NGVEV灭活疫苗的制备第199页
   ·28日龄青年鹅的分组免疫程序及血样采集第199-200页
   ·细胞免疫水平检测第200页
     ·外周血淋巴细胞的分离第200页
     ·淋巴细胞的诱导培养第200页
     ·样品检测及数据处理第200页
   ·体液免疫水平检测第200-202页
     ·间接ELISA实验第200-201页
     ·中和抗体水平检测第201-202页
  3 结果第202-212页
   ·被疫苗免疫青年鹅的健康状况第202页
   ·NGVEV强毒株的TCID_(50)测定第202页
   ·抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定第202-203页
   ·HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定第203页
   ·疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果第203-206页
     ·不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果第203-204页
     ·辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果第204-205页
     ·NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果的比较第205-206页
   ·被疫苗免疫青年鹅的血清IgG水平检测结果第206-209页
     ·不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果第206-207页
     ·辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV-IgG水平的检测结果第207-208页
     ·NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果的比较第208-209页
   ·被疫苗免疫的青年鹅中和抗体水平的检测结果第209-212页
     ·不同剂量NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果第209-210页
     ·辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果第210-211页
     ·NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2 NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果的比较第211-212页
  4 讨论第212-216页
   ·NGVEV灭活疫苗对青年鹅的细胞免疫效果第212-213页
   ·NGVEV灭活疫苗对青年鹅的体液免疫效果第213-214页
   ·GoIL-2对疫苗诱导的细胞免疫及体液免疫反应的影响第214-216页
  5 小结第216-217页
 第十二章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗在开产前种鹅的免疫效果评价第217-229页
  1 材料第217-218页
   ·毒株及佐剂第217页
   ·试验种鹅第217页
   ·主要试剂及配制第217页
   ·主要仪器及设备第217-218页
   ·器材第218页
  2 方法第218-219页
   ·开产前鹅的分组免疫程序及样品的采集第218页
   ·卵黄的收集及处理方法第218页
   ·细胞免疫水平检测第218-219页
   ·体液免疫水平检测第219页
   ·后代雏鹅的攻毒免疫保护力测定第219页
  3 结果第219-226页
   ·被免疫种鹅的健康状况第219页
   ·被免疫种鹅的淋巴细胞增殖试验检测结果第219-220页
   ·被免疫种鹅的血清IgG水平检测结果第220-221页
   ·被免疫种鹅的血清中和抗体水平检测结果第221-222页
   ·被免疫种鹅的卵黄抗NGVEV的IgG水平检测结果第222-223页
   ·被免疫种鹅的卵黄中和抗体水平的检测结果第223-224页
   ·被免疫种鹅的后代雏鹅攻毒保护实验结果第224-226页
  4 讨论第226-228页
  5 小结第228-229页
第三部分 结论第229-233页
第四部分 参考文献第233-263页
致谢第263-264页
作者简介第264页
攻读博士学位期间以第一作者身份发表的论文第264-265页
攻读博士学位期间以非第一作者身份发表的论文第265页

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