| 摘要 | 第1-15页 |
| ABSTRACT | 第15-18页 |
| 缩略词表 | 第18-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-40页 |
| 1 胰岛素信号通路的研究进展 | 第19-21页 |
| ·胰岛素信号通路概述 | 第19-20页 |
| ·胰岛素信号通路与猪主要经济性状 | 第20-21页 |
| ·胰岛素信号通路与糖原合成 | 第20页 |
| ·胰岛素信号通路与蛋白合成 | 第20-21页 |
| ·胰岛素信号通路与脂肪沉积 | 第21页 |
| 2 磷酯酰肌醇信号分子 | 第21-22页 |
| 3 磷酯酰肌醇磷酸酶 | 第22-23页 |
| ·磷酯酰肌醇磷酸酶的分类和结构特性 | 第22-23页 |
| ·第2类磷酯酰肌醇磷酸酶的功能性结构 | 第23页 |
| ·肌醇多磷酸5-磷酸酶的功能结构域和酶活 | 第23页 |
| 4 SKIP的研究进展 | 第23-25页 |
| ·SKIP的发现和分子特征鉴定 | 第23-24页 |
| ·SKIP的5’磷酸酶活性和功能 | 第24页 |
| ·SKIP的染色体定位 | 第24-25页 |
| 5 SHIP2的研究进展 | 第25-26页 |
| ·SHIP2的酶学活性 | 第25页 |
| ·SHIP2的分子结构和表达特征 | 第25页 |
| ·SHIP2参与的细胞功能 | 第25-26页 |
| ·SHIP2与胰岛素信号通路 | 第26页 |
| ·SHIP2的遗传多态性与疾病 | 第26页 |
| 6 基于EST数据的基因克隆策略 | 第26-28页 |
| ·EST的概念和运用 | 第26-27页 |
| ·电子克隆新基因 | 第27页 |
| ·电子克隆的应用 | 第27-28页 |
| 7. 单核苷酸多态(SNP)简述 | 第28-29页 |
| ·关于SNPs | 第28-29页 |
| ·SNPs在猪遗传研究中的应用 | 第29页 |
| 8 真核基因启动子的研究进展 | 第29-34页 |
| ·基础转录和核心启动子 | 第29-30页 |
| ·调控序列与转录激活 | 第30-34页 |
| ·CpG岛与基因的表达 | 第31页 |
| ·MyoD及其bHLH转录因子家族 | 第31-32页 |
| ·E2F转录因子家族 | 第32-33页 |
| ·转录因子Sp1 | 第33-34页 |
| ·启动子和转录因子结合位点的预测和鉴定 | 第34页 |
| 9 定点突变技术 | 第34-35页 |
| 10 RNA干涉技术及其在哺乳动物功能基因研究中的应用现状 | 第35-40页 |
| ·RNAI技术的发现 | 第35-36页 |
| ·哺乳动物的RNA干扰技术的机制 | 第36页 |
| ·RNA干扰技术的特点 | 第36-37页 |
| ·RNA干扰技术的应用进展 | 第37-40页 |
| 第二章 研究的目的与意义 | 第40-41页 |
| 第三章 材料与方法 | 第41-65页 |
| 1 试验材料 | 第41-45页 |
| ·试验样品和性状测定 | 第41-42页 |
| ·DNA样品 | 第41页 |
| ·组织样品 | 第41页 |
| ·性状测定 | 第41页 |
| ·细胞、载体和菌株 | 第41-42页 |
| ·主要仪器和设备 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42-43页 |
| ·主要缓冲液和常用试剂的配制 | 第43-45页 |
| 2 试验方法 | 第45-65页 |
| ·猪基因组DNA的提取 | 第45-46页 |
| ·DNA浓度的测定和质量检测 | 第46页 |
| ·猪11个组织总RNA的提取及cDNA的制备 | 第46-47页 |
| ·总RNA的提取 | 第46-47页 |
| ·RNA的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第47页 |
| ·反转录反应(Reverse transcription RT) | 第47页 |
| ·细胞培养 | 第47-48页 |
| ·猪SKIP和SHIP2基因cDNA序列的分离、克隆及序列分析 | 第48-51页 |
| ·扩增猪SKIP和SHIP2基因cDNA所用引物的设计与合成 | 第48页 |
| ·猪SKIP和SHIP2基因cDNA序列的PCR扩增 | 第48-49页 |
| ·PCR产物的回收、纯化和克隆测序 | 第49-51页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第49页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl2法制备感受态) | 第49-50页 |
| ·载体连接 | 第50页 |
| ·连接产物的转化 | 第50页 |
| ·阳性克隆子的鉴定和测序 | 第50-51页 |
| ·生物信息学软件分析所获cDNA序列 | 第51页 |
| ·猪SKIP和SHIP2基因的组织表达分析 | 第51-52页 |
| ·引物设计 | 第51页 |
| ·RT-PCR反应 | 第51-52页 |
| ·猪SKIP和SHIP2基因多态性检测 | 第52-53页 |
| ·基因多态性扫描和引物设计 | 第52页 |
| ·PCR反应 | 第52页 |
| ·PCR产物回收、纯化和克隆测序 | 第52-53页 |
| ·PCR产物的酶切和检测 | 第53页 |
| ·多态性与性状的关联分析方法 | 第53页 |
| ·在不同猪种中等位基因频率及基因型频率计算 | 第53页 |
| ·分子标记的基因效应分析 | 第53页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第53-54页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒 | 第53-54页 |
| ·酶切鉴定 | 第54页 |
| ·序列测定 | 第54页 |
| ·超纯质粒的提取 | 第54页 |
| ·SKIP基因的干扰分析 | 第54-55页 |
| ·SKIP超表达载体的构建和鉴定 | 第55-56页 |
| ·脂质体介导的细胞转染 | 第56页 |
| ·半定量RT-PCR反应 | 第56-57页 |
| ·转染细胞的RNA提取和纯化 | 第56-57页 |
| ·反转录反应 | 第57页 |
| ·半定量引物的设计 | 第57页 |
| ·RT-PCR反应 | 第57页 |
| ·WESTERN-BLOT分析 | 第57-59页 |
| ·蛋白的提取 | 第57-58页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第58页 |
| ·Western-blot杂交 | 第58-59页 |
| ·细胞生长曲线的测定 | 第59页 |
| ·糖原合成分析 | 第59页 |
| ·猪SKIP基因启动子序列的分离、鉴定 | 第59-61页 |
| ·步移引物设计 | 第59-60页 |
| ·基因组PCR步移 | 第60页 |
| ·步移产物的回收克隆和测序 | 第60-61页 |
| ·生物信息学分析 | 第61页 |
| ·猪SKIP和SKIP基因启动子表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·启动子缺失片段引物设计 | 第61页 |
| ·启动子片段PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·目的片段和pGL3-basic载体的双酶切和检测 | 第62页 |
| ·酶切产物的回收 | 第62页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第62-63页 |
| ·质粒提取 | 第63页 |
| ·定点突变 | 第63页 |
| ·化学合成MYOD-SIRNA和Sp1-SIRNA的设计 | 第63页 |
| ·实时定量PCR | 第63-64页 |
| ·数据分析 | 第64页 |
| ·启动子的荧光素酶活性分析 | 第64-65页 |
| 第四章 结果与分析 | 第65-105页 |
| 1 RNA的提取 | 第65页 |
| 2 猪SKIP基因的序列分析 | 第65-68页 |
| ·猪SKIP基因的cDNA序列的分离与克隆 | 第65-66页 |
| ·猪SKIP基因cDNA序列的生物信息学分析 | 第66页 |
| ·猪SKIP的分子特征预测 | 第66-67页 |
| ·猪SKIP基因的染色体定位 | 第67页 |
| ·SKIP的系统进化树分析 | 第67-68页 |
| 3 猪SKIP基因的半定量组织表达谱分析 | 第68页 |
| 4 猪SKIP基因的遗传多态性分析 | 第68-78页 |
| ·猪SKIP基因的SNPs检测 | 第68-69页 |
| ·猪SKIP基因第12外显子多态性检测 | 第69-70页 |
| ·猪SKIP基因第12外显子多态与性状关联分析 | 第70-72页 |
| ·猪SKIP基因第6内含子多态性检测 | 第72-73页 |
| ·猪SKIP基因第6内含子多态与性状关联分析 | 第73-75页 |
| ·猪SKIP基因第1内含子多态性检测 | 第75-76页 |
| ·猪SKIP基因第1内含子多态与性状关联分析 | 第76-78页 |
| 5 猪SHIP2基因的CDNA序列分析 | 第78-80页 |
| ·猪SHIP2基因的cDNA序列的分离与克隆 | 第78-79页 |
| ·猪SHIP2基因的生物信息学分析 | 第79页 |
| ·SHIP2的系统进化树分析 | 第79-80页 |
| 6 猪SHIP2基因的半定量组织表达谱分析 | 第80页 |
| 7 猪SHIP2基因的遗传多态性分析 | 第80-83页 |
| ·猪SHIP2基因的SNPs检测 | 第80-81页 |
| ·猪SHIP2基因第21内含子多态性检测 | 第81页 |
| ·猪SHIP2基因第21内含子多态与性状关联分析 | 第81-83页 |
| 8 SKIP基因的干扰分析 | 第83-91页 |
| ·干扰载体的双酶切鉴定 | 第83-84页 |
| ·SKIP小干扰RNA表达载体的鉴定 | 第84-85页 |
| ·SKIP-小干扰RNA对猪肾IBRS-2细胞中SKIPMRNA水平的影响 | 第85-86页 |
| ·SKIP-小干扰RNA对猪肾IBRS-2细胞生长的影响 | 第86页 |
| ·SKIP-小干扰RNA对C2C12细胞中SKIP蛋白水平的影响 | 第86-87页 |
| ·SKIP表达抑制对胰岛素介导的AKT和GSK-3磷酸化的影响 | 第87-89页 |
| ·SKIP表达抑制对胰岛素介导的糖原合酶的影响 | 第89-90页 |
| ·SKIP表达抑制对胰岛素介导的糖原合成的影响 | 第90-91页 |
| 9 SKIP在肌细胞的分化过程中表达上调 | 第91-92页 |
| 10 猪SKIP基因启动子的获得 | 第92-94页 |
| 11 猪SKIP基因启动子序列分析和缺失片段的构建 | 第94-96页 |
| 12 猪SKIP基因的表达调控分析 | 第96-99页 |
| ·猪SKIP基因启动子活性分析 | 第96-97页 |
| ·MYOD在骨骼肌分化过程中调节SKIP的高表达 | 第97-98页 |
| ·在骨骼肌分化过程中SP1协同MYOD调节SKIP的启动子活性 | 第98-99页 |
| 13 猪SHIP2基因启动子序列分析 | 第99-101页 |
| 14 SHIP2基因的表达调控 | 第101-105页 |
| ·SHIP2在肌细胞分化早期表达上调,在分化中晚期表达下调 | 第101页 |
| ·猪SHIP2基因启动子活性分析 | 第101-103页 |
| ·MYOD在骨骼肌分化过程中调节SHIP2的高表达 | 第103页 |
| ·在肌细胞和肾细胞中SP1参与调节SHIP2的启动子活性 | 第103-104页 |
| ·E2F在成肌前体细胞中介导SHIP2转录激活,在成肌细胞中介导SHIP2的转录抑制 | 第104-105页 |
| 第五章 讨论 | 第105-113页 |
| 1 SKIP在胰岛素信号通路中的调控 | 第105-106页 |
| ·SKIP调节AKT的活性 | 第105页 |
| ·SKIP与AKT-GSK3信号通路 | 第105-106页 |
| ·SKIP与糖代谢 | 第106页 |
| 2 其它磷酸酶对糖代谢的调控 | 第106页 |
| 3 猪SKIP与生长、肉质性状 | 第106-107页 |
| 4 SKIP与细胞骨架的重排 | 第107页 |
| 5 顺式作用元件与组织表达特异性 | 第107页 |
| 6 猪SKIP基因的表达调控 | 第107-109页 |
| ·猪SKIP基因的启动子特性 | 第107-108页 |
| ·MYOD和E-BOX介导肌细胞中SKIP基因的表达 | 第108页 |
| ·TGF-B对SKIP基因的调控 | 第108-109页 |
| ·转录因子SP1和MYOD互作介导SKIP的表达 | 第109页 |
| 7 猪SHIP2基因与生长性状 | 第109-110页 |
| 8 SHIP2基因与细胞分化 | 第110页 |
| 9 猪SHIP2基因的表达调控 | 第110-113页 |
| ·猪SHIP2基因的启动子特性 | 第110页 |
| ·转录因子SP1介导SHIP2基因的表达 | 第110-111页 |
| ·E2F顺式作用元件介导SHIP2在不同细胞周期中的表达 | 第111页 |
| ·MYOD参与调控SHIP2的表达 | 第111-112页 |
| ·多个转录因子协同调节SHIP2的表达 | 第112-113页 |
| 小结 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-133页 |
| 附录一 猪SKIP和SHIP2基因多态性扫描所用的引物序列及特征 | 第133-135页 |
| 附录二 定量PCR所用小鼠引物 | 第135-136页 |
| 博士在读期间发表论文 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
