| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 英文缩略对照表 | 第12-14页 |
| 第1章 前言 | 第14-32页 |
| 1.1 RNA聚合酶Ⅱ及其负责的真核基因转录 | 第15-21页 |
| 1.1.1 真核生物RNA聚合酶 | 第15页 |
| 1.1.2 RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)的结构 | 第15-17页 |
| 1.1.3 RNA聚合酶Ⅱ参与的真核基因转录过程 | 第17-19页 |
| 1.1.4 P-TEFb复合体及其功能 | 第19-21页 |
| 1.2 RNA聚合酶Ⅱ CTD及其磺酸化循环 | 第21-25页 |
| 1.2.1 CTD七肽重复序列的结构 | 第21-23页 |
| 1.2.2 CTD的磷酸化循环 | 第23-25页 |
| 1.3 磷酸化蛋白质组学定量技术 | 第25-29页 |
| 1.3.1 放射性标记法 | 第26页 |
| 1.3.2 荧光检测法 | 第26页 |
| 1.3.3 稳定同位素标记技术 | 第26-29页 |
| 1.4 质谱技术分析CTD磷酸化模式的研究进展 | 第29-30页 |
| 1.5 研究内容和意义 | 第30-32页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第32-50页 |
| 2.1 实验药品、试剂与仪器 | 第32-35页 |
| 2.1.1 细胞株、菌株和质粒资源 | 第32页 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 | 第32-33页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第33-35页 |
| 2.2 常用溶液配方 | 第35-39页 |
| 2.3 实验方法 | 第39-50页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| 2.3.2 质粒转化 | 第40页 |
| 2.3.3 质粒小量提取 | 第40-41页 |
| 2.3.4 质粒大量提取 | 第41页 |
| 2.3.5 贴壁细胞的培养 | 第41-42页 |
| 2.3.6 真核细胞瞬时转染(PEI脂质载体瞬时转染法) | 第42页 |
| 2.3.7 全细胞裂解 | 第42-43页 |
| 2.3.8 免疫亲和纯化 | 第43页 |
| 2.3.9 原核蛋白表达 | 第43-44页 |
| 2.3.10 GST pulldown | 第44页 |
| 2.3.11 AKTA pure系统纯化蛋白 | 第44-45页 |
| 2.3.12 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第45页 |
| 2.3.13 蛋白免疫印迹实验(Western blot) | 第45-46页 |
| 2.3.14 考马斯亮蓝R-250染色 | 第46页 |
| 2.3.15 体外激酶反应 | 第46页 |
| 2.3.16 截留柱辅助的质谱检测蛋白样品制备(FASP) | 第46-47页 |
| 2.3.17 微波辅助酸水解蛋白(MAAH) | 第47-48页 |
| 2.3.18 肽段样品除盐 | 第48-50页 |
| 2.3.18.1 Ziptip除盐 | 第48页 |
| 2.3.18.2 Stop and go extraction tips除盐 | 第48-50页 |
| 第3章 实验结果与讨论 | 第50-78页 |
| 3.1 实验结果 | 第50-76页 |
| 3.1.1 P-TEFb纯化条件的优化 | 第50-52页 |
| 3.1.2 GST-CTD的原核表达及纯化 | 第52-55页 |
| 3.1.3 胰酶酶切GST-CTD | 第55-58页 |
| 3.1.4 微波辅助酸水解法(MAAH)消化未酶解氨基酸片段 | 第58-62页 |
| 3.1.5 P-TEFb体外磷酸化GST-CTD | 第62-76页 |
| 3.2 讨论 | 第76-78页 |
| 第4章 小结与展望 | 第78-80页 |
| 4.1 小结 | 第78-79页 |
| 4.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-91页 |
| 附录 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
