| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-29页 |
| 1.1 谷氨酸棒状杆菌概述 | 第11页 |
| 1.2 谷氨酸棒状杆菌蛋白表达系统 | 第11-14页 |
| 1.3 谷氨酸棒状杆菌表达系统优化策略 | 第14-18页 |
| 1.3.1 发掘新的启动子 | 第14-15页 |
| 1.3.2 表达载体的优化 | 第15页 |
| 1.3.3 宿主细胞的改造 | 第15-17页 |
| 1.3.4 基因改造工具的开发 | 第17-18页 |
| 1.4 CRISPR/CAS基因编辑系统 | 第18-22页 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas基因编辑系统概述 | 第18-19页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统作用机制 | 第19-20页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas系统分类 | 第20页 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas在基因编辑中的应用 | 第20-21页 |
| 1.4.5 CRISPR/Cas系统在谷氨酸棒状杆菌中的应用 | 第21-22页 |
| 1.5 潜在的谷氨酸棒状杆菌优化靶点 | 第22-26页 |
| 1.5.1 肽聚糖内切酶MepA | 第22-23页 |
| 1.5.2 细胞表面阴离子通道蛋白PorB | 第23页 |
| 1.5.3 谷氨酸棒状杆菌中蛋白酶系统 | 第23-25页 |
| 1.5.4 谷氨酸棒杆菌中的双组份系统 | 第25-26页 |
| 1.6 立题依据及主要的研究内容 | 第26-29页 |
| 第二章 CRISPR/CAS9基因编辑系统的构建 | 第29-53页 |
| 2.1 前言 | 第29页 |
| 2.2 材料方法 | 第29-38页 |
| 2.2.1 材料 | 第29-32页 |
| 2.2.2 方法 | 第32-38页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第38-50页 |
| 2.3.1 载体pFST及pFSC的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.2 谷氨酸棒状杆菌中基因编辑效率的验证 | 第39-42页 |
| 2.3.3 不同同源修复片段长度的基因编辑效率 | 第42-43页 |
| 2.3.4 不同基因的基因编辑效率 | 第43页 |
| 2.3.5 用于基因定点突变及基因片段插入 | 第43-45页 |
| 2.3.6 不同sgRNA对基因敲除效率的影响 | 第45-46页 |
| 2.3.7 All-in-oneCRISPR/Cas9系统的构建 | 第46-47页 |
| 2.3.8 All-in-oneCRISPR/Cas9系统的检测 | 第47-48页 |
| 2.3.9 脱靶效应分析 | 第48-49页 |
| 2.3.10 质粒消除效果 | 第49-50页 |
| 2.4 本章小结 | 第50-53页 |
| 第三章 谷氨酸棒状杆菌外源蛋白高效表达宿主的改造 | 第53-69页 |
| 3.1 前言 | 第53页 |
| 3.2 材料方法 | 第53-61页 |
| 3.2.1 材料 | 第53-57页 |
| 3.2.2 方法 | 第57-61页 |
| 3.3 结果与分析 | 第61-68页 |
| 3.3.1 不同溶氧浓度对C.glutamicum转录组的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.2 MepA结构预测及基因保守结构域分析 | 第62-63页 |
| 3.3.3 PorB结构预测及保守域分析 | 第63页 |
| 3.3.4 mepA和porB基因与外源蛋白表达密切相关 | 第63-64页 |
| 3.3.5 mepA和porB敲除对具体生长的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.6 三基因敲除菌株的构建 | 第65-66页 |
| 3.3.7 GFP表达检测 | 第66页 |
| 3.3.8 scFv表达检测 | 第66-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 NT-PROBNP在谷氨酸棒状杆菌中的表达 | 第69-85页 |
| 4.1 前言 | 第69-70页 |
| 4.2 材料与方法 | 第70-75页 |
| 4.2.1 材料 | 第70-71页 |
| 4.2.2 方法 | 第71-75页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第75-82页 |
| 4.3.1 谷氨酸棒状杆菌中GFP不同表达模式菌株的构建 | 第75页 |
| 4.3.2 GFP在谷氨酸棒状杆菌中的表达分析 | 第75-76页 |
| 4.3.3 不同表达模式下gfp转录水平分析 | 第76-77页 |
| 4.3.4 谷氨酸棒状杆菌中NT-proBNP不同表达模式菌株的构建 | 第77页 |
| 4.3.5 NT-proBNP蛋白在谷氨酸棒状杆菌中的表达分析 | 第77-78页 |
| 4.3.6 不同菌株中NT-proBNP的表达 | 第78-81页 |
| 4.3.7 分批补料发酵生产NT-proBNP | 第81-82页 |
| 4.3.8 NT-proBNP的纯化及抗原特性分析 | 第82页 |
| 4.4 本章小结 | 第82-85页 |
| 第五章 PORB与MEPA影响外源蛋白表达的机理研究 | 第85-101页 |
| 5.1 前言 | 第85-86页 |
| 5.2 材料方法 | 第86-92页 |
| 5.2.1 材料 | 第86-88页 |
| 5.2.2 方法 | 第88-92页 |
| 5.3 结果与分析 | 第92-100页 |
| 5.3.1 mprA、mprB、phoP、phoR敲除菌株的构建 | 第92-93页 |
| 5.3.2 mepA、porB、mprA和phoP过表达菌株的构建 | 第93页 |
| 5.3.3 MepA和PorB对细胞生存能力的影响 | 第93-94页 |
| 5.3.4 MepA对胞内ATP水平的影响作用 | 第94-95页 |
| 5.3.5 转录组中mepA和porB相关基因的转录水平变化 | 第95-96页 |
| 5.3.6 mepA和porB相关基因的荧光定量结果 | 第96-99页 |
| 5.3.7 mepA和porB与双组份系统及sigma因子之间的调控关系 | 第99-100页 |
| 5.4 本章小结 | 第100-101页 |
| 主要结论与展望 | 第101-103页 |
| 主要结论 | 第101-102页 |
| 展望 | 第102-103页 |
| 论文创新点 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-119页 |
| 附表 第二章中所用引物序列 | 第119-123页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第123页 |
