| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 前言 | 第13-16页 |
| 第一部分 CD147与肿瘤细胞的耐药性相关 | 第16-41页 |
| 引言 | 第16页 |
| 1.1 实验材料 | 第16-20页 |
| 1.1.1 肿瘤细胞系来源 | 第16页 |
| 1.1.2 载体及菌种 | 第16页 |
| 1.1.3 试剂 | 第16-17页 |
| 1.1.4 仪器 | 第17-19页 |
| 1.1.5 主要溶液的配置 | 第19-20页 |
| 1.2 实验方法 | 第20-34页 |
| 1.2.2 利用qPCR检测转染前后CD147基因的表达情况 | 第22-23页 |
| 1.2.3 WesternBlot检测不同肿瘤细胞系中CD147的蛋白表达情况 | 第23-26页 |
| 1.2.4 流式检测不同肿瘤细胞系中CD147的表达情况 | 第26页 |
| 1.2.5 CRISPR-Cas9-CD147敲除质粒的构建及其敲除功能的验证 | 第26-32页 |
| 1.2.6 敲除质粒PX458-CD147转染MCF-7/Adr | 第32-33页 |
| 1.2.7 MTT检测细胞活性及对阿霉素的耐药性 | 第33页 |
| 1.2.8 统计分析 | 第33-34页 |
| 1.3 结果 | 第34-40页 |
| 1.3.1 RT-PCR检测不同肿瘤细胞系中CD147的mRNA表达情况 | 第34页 |
| 1.3.2 WesternBlot检测不同肿瘤细胞系中CD147的蛋白表达情况 | 第34页 |
| 1.3.3 流式细胞仪检测不同肿瘤细胞系中CD147的表达情况 | 第34-35页 |
| 1.3.4 pX458-CD147敲除质粒的构建 | 第35-36页 |
| 1.3.5 检测pX458-CD147质粒对细胞的转染情况 | 第36-37页 |
| 1.3.6 pX458-CD147对293T细胞系的敲除效率的验证 | 第37-38页 |
| 1.3.7 PX458-CD147转染MCF-7/Adr细胞后CD147基因的表达情况 | 第38-39页 |
| 1.3.8 MTT检测转染后MCF-7/Adr细胞对阿霉素的耐药性 | 第39-40页 |
| 1.4 讨论 | 第40-41页 |
| 第二章 点突变CD147抗原表位的生物信息学分析及肽-MHC的稳定性检测 | 第41-50页 |
| 引言 | 第41页 |
| 2.1 材料 | 第41-43页 |
| 2.1.1 CD147基因信息及氨基酸全序列 | 第41页 |
| 2.1.2 细胞系 | 第41页 |
| 2.1.3 试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.4 仪器 | 第42页 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 | 第42-43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-44页 |
| 2.2.1 利用BIMAS在线预测系统分析CD147抗原CTL表位 | 第43页 |
| 2.2.2 利用SYFPEITHI在线预测系统分析CD147抗原CTL表位 | 第43-44页 |
| 2.2.3 肽与MHC分子亲和力检测 | 第44页 |
| 2.2.4 肽MHC复合物稳定性实验 | 第44页 |
| 2.3 结果 | 第44-49页 |
| 2.3.1 CD147抗原CTL表位的BIMAS预测结果 | 第44-46页 |
| 2.3.2 CD147抗原CTL表位的SYFPEITHI预测结果 | 第46-47页 |
| 2.3.3 野生型抗原表位筛选 | 第47页 |
| 2.3.4 野生型抗原表位突变设计 | 第47页 |
| 2.3.5 肽与HLAA2分子亲和力验证 | 第47-48页 |
| 2.3.6 肽与HLAA2分子稳定性验证 | 第48-49页 |
| 2.4 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 候选表位肽体外诱导抗肿瘤特异性CTL | 第50-63页 |
| 引言 | 第50页 |
| 3.1 实验材料 | 第50-52页 |
| 3.1.1 健康人外周血样本采集 | 第50页 |
| 3.1.2 细胞系 | 第50页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第50-51页 |
| 3.1.4 实验仪器 | 第51-52页 |
| 3.2 方法 | 第52-56页 |
| 3.2.1 健康人外周血HLA分型检测 | 第52页 |
| 3.2.2 健康人PBMC的分离 | 第52-53页 |
| 3.2.3 PBMCs冻存 | 第53页 |
| 3.2.4 诱导成熟DC | 第53-54页 |
| 3.2.5 DC细胞表型分析 | 第54页 |
| 3.2.6 Elispot检测抗原肽的免疫原性 | 第54-55页 |
| 3.2.7 钙黄绿素-AM(Calcein-AM)荧光检测CTL对靶细胞的杀伤活性 | 第55-56页 |
| 3.2.8 统计学分析 | 第56页 |
| 3.3 结果 | 第56-61页 |
| 3.3.1 流式检测肿瘤细胞以及健康人外周血样本HLA分型 | 第56-57页 |
| 3.3.2 DC细胞形态学观察 | 第57页 |
| 3.3.3 流式检测DC细胞诱导成熟前后细胞表型 | 第57-58页 |
| 3.3.4 Elispot检测不同表位肽刺激活化的淋巴细胞数目 | 第58-59页 |
| 3.3.5 表位肽刺激诱导的CTL对负载肽的T2靶细胞的细胞毒作用 | 第59页 |
| 3.3.6 表位肽刺激诱导的CTL对肿瘤细胞的细胞毒作用 | 第59-60页 |
| 3.3.7 抗体阻断实验检测突变肽CD147126-134L2诱导的CTL对靶细胞的细胞毒作用 | 第60-61页 |
| 3.4 小结 | 第61-63页 |
| 第四章 CD147_(126-134)L2肽诱导前后T细胞TCR家族CDR3谱型的初步分析 | 第63-75页 |
| 引言 | 第63页 |
| 4.1 实验材料 | 第63页 |
| 4.1.1 实验样本 | 第63页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第63页 |
| 4.1.3 仪器 | 第63页 |
| 4.2 方法 | 第63-70页 |
| 4.2.1 RNA的提取 | 第63-64页 |
| 4.2.2 逆转录 | 第64-65页 |
| 4.2.3 多重PCR扩增细胞样品中TCRVα的CDR3片段 | 第65-68页 |
| 4.2.4 多重PCR扩增细胞样品中TCRVβ的CDR3片段 | 第68-70页 |
| 4.3 结果 | 第70-74页 |
| 4.3.1 毛细管电泳检测体外CD147_(126-134)L2刺激前后T淋巴细胞中TCRVα链基因表达情况 | 第70-73页 |
| 4.3.2 毛细管电泳检测体外CD147_(126-13)4L2刺激前后T淋巴细胞中TCRVβ链基因表达情况 | 第73-74页 |
| 4.4 小结 | 第74-75页 |
| 讨论 | 第75-78页 |
| 参考文献 | 第78-89页 |
| 附录一 英文缩略词表 | 第89-90页 |
| 附录二 质粒图谱 | 第90-92页 |
| 附录三 攻读学位期间发表的论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
