| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 中度嗜盐菌(Moderate halophile)简介 | 第12-14页 |
| 1.1.1 中度嗜盐菌生长特性及分布 | 第12-13页 |
| 1.1.2 中度嗜盐菌耐盐机理 | 第13页 |
| 1.1.3 相容性溶质 | 第13-14页 |
| 1.2 钠离子输出系统 | 第14-23页 |
| 1.2.1 初级钠泵 | 第14页 |
| 1.2.2 次级钠泵(Na~+/H~+逆向转运蛋白) | 第14-19页 |
| 1.2.2.1 Ec-NhaA结构及作用机理 | 第15-18页 |
| 1.2.2.2 Ec-NhaA感应pH调控机理 | 第18-19页 |
| 1.2.3 NhaD型Na~+/H~+逆向转运蛋白研究进展 | 第19-21页 |
| 1.2.4 NhaD型Na~+/H~+逆向转运蛋白转运机理研究 | 第21-23页 |
| 1.3 本论文研究价值及工作思路 | 第23-24页 |
| 第二章 逆向转运蛋白基因nhaD1、nhaD2生长互补功能研究 | 第24-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.2 培养基及所需溶液 | 第25-26页 |
| 2.1.3 实验仪器设备 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-28页 |
| 2.2.1 E.coli KNabc/pEASYBlunt-nhaD1与/E.coli KNabc/pEASYBlunt-nhaD2菌株的构建 | 第26页 |
| 2.2.2 NhaD1与NhaD2对E.coli KNabc菌株Na~+耐受性互补生长 | 第26-27页 |
| 2.2.3 NhaD1与NhaD2对E.coli KNabc在Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第27页 |
| 2.2.4 NhaD1与NhaD2对E.coli KNabc Li~+耐受性互补生长 | 第27页 |
| 2.2.5 NhaD1与NhaD2对E.coli KNabc在Li~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第27-28页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第28-30页 |
| 2.3.1 NhaD1与NhaD2对Na~+耐受性及在Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第28-29页 |
| 2.3.2 NhaD1与NhaD2对Li~+耐受性及在Li~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第29-30页 |
| 2.4 本章小结 | 第30-32页 |
| 第三章 NhaD1、NhaD2蛋白反转膜制备与逆向转运活性测定 | 第32-40页 |
| 3.1 实验材料 | 第32-34页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第32-33页 |
| 3.1.2 培养基及所需溶液 | 第33-34页 |
| 3.1.3 实验仪器设备 | 第34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-36页 |
| 3.2.1 反转膜(EMVs)的制备 | 第34-35页 |
| 3.2.2 反转膜(EMVs)荧光检测 | 第35页 |
| 3.2.3 不同pH下反转膜对Na~+及Li~+转运活性测定 | 第35页 |
| 3.2.4 反转膜对Na~+(Li~+)表观K_m值测定 | 第35-36页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第36-39页 |
| 3.3.1 反转膜中NhaD1及NhaD2转运蛋白Na~+(Li~+)/H~+活性pH依赖性 | 第36-38页 |
| 3.3.2 反转膜中NhaD1及NhaD2转运蛋白Na~+(Li~+)/H~+活性表观K_m值 | 第38-39页 |
| 3.4 本章小结 | 第39-40页 |
| 第四章 NhaD1定点突变体构建及转运功能分析 | 第40-54页 |
| 4.1 实验材料 | 第40-42页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第40-41页 |
| 4.1.2 培养基及所需溶液 | 第41-42页 |
| 4.1.3 实验仪器设备 | 第42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-47页 |
| 4.2.1 多序列比对 | 第42-43页 |
| 4.2.2 引物设计 | 第43-44页 |
| 4.2.3 E.coli KNabc感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 4.2.4 NhaD1突变体的构建(以V86I为例) | 第45-46页 |
| 4.2.5 转化子验证 | 第46-47页 |
| 4.2.6 突变体菌株对E.coli KNabc Na~+耐受性互补生长 | 第47页 |
| 4.2.7 突变体菌株对E.coli KNabc在Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第47页 |
| 4.2.8 突变体菌株反转膜制备及转运活性的测定 | 第47页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第47-52页 |
| 4.3.1 确定突变位点 | 第47-48页 |
| 4.3.2 突变菌株Na~+耐受性及在Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第48-49页 |
| 4.3.3 突变菌株反转膜活性测定 | 第49-52页 |
| 4.4 本章小结 | 第52-54页 |
| 第五章 嵌合体蛋白的构建及关键区域分析 | 第54-75页 |
| 5.1 实验材料 | 第55-56页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第55页 |
| 5.1.2 培养基及所需溶液 | 第55-56页 |
| 5.1.3 实验仪器设备 | 第56页 |
| 5.2 实验方法 | 第56-63页 |
| 5.2.1 确定嵌合体构建方案 | 第56-58页 |
| 5.2.2 嵌合体引物设计 | 第58-61页 |
| 5.2.3 嵌合体菌株的构建(以C40片段为例) | 第61-62页 |
| 5.2.4 转化子验证 | 第62页 |
| 5.2.5 嵌合体菌株对E.coli KNabc Na~+耐受性互补生长 | 第62页 |
| 5.2.6 嵌合体菌株对E.coli KNabc在Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第62页 |
| 5.2.7 嵌合体菌株反转膜制备及转运活性的测定 | 第62-63页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第63-74页 |
| 5.3.1 嵌合体菌株构建及电泳验证 | 第63-66页 |
| 5.3.2 嵌合体菌株Na~+耐受性以及Na~+胁迫下耐碱性互补生长 | 第66-67页 |
| 5.3.3 NhaD1嵌合体菌株反转膜活性测定 | 第67-70页 |
| 5.3.4 NhaD2嵌合体菌株反转膜活性测定 | 第70-73页 |
| 5.3.5 嵌合体N末端重要性分析 | 第73-74页 |
| 5.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 总结与展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 发表论文 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第85页 |
