| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第14-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-30页 |
| 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型简述 | 第17-18页 |
| 1.2 HSV 的形态与结构 | 第18页 |
| 1.3 HSV-2 基因组结构和基因表达 | 第18-20页 |
| 1.3.1 HSV-2 基因组结构 | 第18-19页 |
| 1.3.2 HSV-2 的基因表达 | 第19-20页 |
| 1.4 单纯疱疹病毒的 LAT 基因 | 第20-21页 |
| 1.4.1 LAT 家族 | 第20页 |
| 1.4.2 LAT 的开放读码框（ORF） | 第20-21页 |
| 1.4.3 LAT 的启动子 | 第21页 |
| 1.5 LAT 基因的作用机制 | 第21-27页 |
| 1.5.1 LAT 下调单纯疱疹病毒裂解基因的表达 | 第21-22页 |
| 1.5.2 LAT 的抗凋亡作用 | 第22-23页 |
| 1.5.3 LAT 抗凋亡作用的区域 | 第23页 |
| 1.5.4 LAT 抗凋亡作用的机制 | 第23-27页 |
| 1.5.4.1 LAT 通过编码蛋白质介导抗凋亡功能 | 第23-24页 |
| 1.5.4.2 潜伏相关转录体（LAT）通过编码 microRNA 执行抗凋亡功能 | 第24-27页 |
| 1.6 本课题主要内容及意义 | 第27-30页 |
| 1.6.1 本课题的研究意义 | 第27-29页 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 | 第29-30页 |
| 第二章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT RL1 真核表达载体的构建 | 第30-49页 |
| 2.1 前言 | 第30页 |
| 2.2 主要实验材料 | 第30-34页 |
| 2.2.1 实验耗材和仪器 | 第30-31页 |
| 2.2.2 细胞、病毒株、菌株和质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第32页 |
| 2.2.4 溶液和培养基 | 第32-34页 |
| 2.3 技术路线 | 第34页 |
| 2.4 实验方法 | 第34-43页 |
| 2.4.1 复苏非洲绿猴肾细胞 | 第34页 |
| 2.4.2 传代非洲绿猴肾细胞 | 第34-35页 |
| 2.4.3 冻存非洲绿猴肾细胞 | 第35页 |
| 2.4.4 单纯疱疹病毒Ⅱ型培养 | 第35页 |
| 2.4.5 提取单纯疱疹病毒基因组 DNA | 第35-37页 |
| 2.4.6 PCR 扩增单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 序列的 | 第37页 |
| 2.4.7 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物 | 第37-38页 |
| 2.4.8 凝胶回收纯化 PCR 产物 | 第38-39页 |
| 2.4.9 pEGFP-C2 真核表达质粒的扩增 | 第39-41页 |
| 2.4.9.1 大肠杆菌细胞感受态的制备 | 第39页 |
| 2.4.9.2 质粒 pEGFP-C2 转化 | 第39-40页 |
| 2.4.9.3 提取 pEGFP-C2 质粒 | 第40-41页 |
| 2.4.10 pEGFP-C2 空载体和单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2） LAT-RL1 序列的双酶切 | 第41页 |
| 2.4.11 双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳验证 | 第41页 |
| 2.4.12 回收纯化双酶切的产物 | 第41页 |
| 2.4.13 单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）RL1 序列和大肠杆菌质粒pEGFP-C2 连接 | 第41-42页 |
| 2.4.14 大肠杆菌 Top10 感受态细胞制备 | 第42页 |
| 2.4.15 连接产物的转化 | 第42页 |
| 2.4.16 阳性菌落 PCR 的初步鉴定 | 第42-43页 |
| 2.4.17 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 的提取 | 第43页 |
| 2.4.18 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 单双酶切鉴定 | 第43页 |
| 2.4.19 双酶切目的产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第43页 |
| 2.4.20 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 上 RL1 序列的测序鉴定 | 第43页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第43-48页 |
| 2.5.1 Vero 细胞 CPE 病变 | 第43-44页 |
| 2.5.2 HSV-2 LAT 基因 RL1 序列的 PCR 扩增 | 第44页 |
| 2.5.3 阳性菌落的 PCR 鉴定 | 第44-45页 |
| 2.5.4 重组真核表达载体 pEGFP-C2/LAT RL1 的酶切和测序鉴定 | 第45页 |
| 2.5.5 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 的测序鉴定 | 第45-48页 |
| 2.6 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 在真核细胞中的表达及鉴定 | 第49-61页 |
| 3.1 前言 | 第49页 |
| 3.2 主要实验材料 | 第49-51页 |
| 3.2.1 实验仪器和耗材 | 第49-50页 |
| 3.2.2 细胞、菌株和质粒 | 第50页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第50页 |
| 3.2.4 溶液 | 第50-51页 |
| 3.3 技术路线 | 第51页 |
| 3.4 实验方法 | 第51-57页 |
| 3.4.1 小提无内毒素质粒 | 第51-52页 |
| 3.4.2 质粒浓度的测定 | 第52页 |
| 3.4.3 Vero 细胞的培养 | 第52-53页 |
| 3.4.3.1 Vero 细胞的复苏 | 第52-53页 |
| 3.4.3.2 Vero 细胞的传代培养 | 第53页 |
| 3.4.3.3 Vero 细胞的冻存 | 第53页 |
| 3.4.4 PC12 细胞的培养 | 第53-54页 |
| 3.4.5 重组质粒转染 Vero 细胞和 PC12 细胞 | 第54-55页 |
| 3.4.6 RT-PCR 鉴定 LAT-RL1 转录 | 第55-57页 |
| 3.4.6.1 提取 Vero 和 PC12 细胞总的 RNA | 第55-56页 |
| 3.4.6.2 逆转录得到第一链 cDNA | 第56页 |
| 3.4.6.3 以逆转录所得的 cDNA 为模板进行 PCR | 第56-57页 |
| 3.5 结果与讨论 | 第57-59页 |
| 3.5.1 Vero 细胞的培养 | 第57页 |
| 3.5.2 PC12 细胞的培养 | 第57-58页 |
| 3.5.3 质粒在 Vero 和 PC12 细胞中的表达 | 第58-59页 |
| 3.5.4 RT-PCR 检测 LAT- RL1 在 Vero 细胞中的表达 | 第59页 |
| 3.6 小结 | 第59-61页 |
| 第四章 单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT-RL1片段对Vero细胞及PC12细胞的抗凋亡作用研究及 miRNA的筛选 | 第61-88页 |
| 4.1 前言 | 第61页 |
| 4.2 主要实验材料 | 第61-65页 |
| 4.2.1 仪器和设备 | 第61-62页 |
| 4.2.2 菌株、质粒和细胞 | 第62-63页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第63页 |
| 4.2.4 溶液 | 第63-65页 |
| 4.3 技术路线 | 第65页 |
| 4.4 实验方法 | 第65-75页 |
| 4.4.1 Vero 细胞及 PC12 细胞的的培养 | 第65页 |
| 4.4.2 质粒转染 Vero 和 PC12 细胞 | 第65-67页 |
| 4.4.3 G418 对筛选稳定转染的细胞 | 第67页 |
| 4.4.4 放线菌素 D(actinomycin D，ACTD)诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡 | 第67-68页 |
| 4.4.5 MTT 法检测细胞增殖 | 第68页 |
| 4.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第68页 |
| 4.4.7 Hoechst33342 荧光染色观察细胞凋亡 | 第68-69页 |
| 4.4.8 JC-1 细胞凋亡线粒体膜电位检测 | 第69-70页 |
| 4.4.9 DNA ladder 检测细胞凋亡 | 第70页 |
| 4.4.10 Caspase 3 凋亡蛋白检测 | 第70-71页 |
| 4.4.11 Vero 和 PC12 细胞总蛋白鉴定 | 第71-72页 |
| 4.4.11.1 Vero 和 PC12 细胞总蛋白的提取 | 第71页 |
| 4.4.11.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定、分离蛋白质 | 第71-72页 |
| 4.4.12 qRT-PCR 检测 HSV-2 LAT RL1 编码的 microRNA | 第72-75页 |
| 4.4.12.1 引物的设计和合成 | 第73页 |
| 4.4.12.2 总 RNA 提取 | 第73页 |
| 4.4.12.3 逆转录实验 | 第73-74页 |
| 4.4.12.4 荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 | 第74页 |
| 4.4.12.5 统计学分析实验结果 | 第74-75页 |
| 4.5 结果与讨论 | 第75-85页 |
| 4.5.1 质粒 pEGFP-RL1 在 Vero 细胞中及 PC12 细胞中表达的荧光特点 | 第75页 |
| 4.5.2 放线菌素 D 诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡模型的建立 | 第75-77页 |
| 4.5.3 电转化及 G418 细胞稳定表达筛选 | 第77页 |
| 4.5.4 MTT 法测重组质粒对 Vero 细胞及 PC12 细胞活性的影响 | 第77-78页 |
| 4.5.5 Hochest 33342 染色观察细胞凋亡 | 第78-79页 |
| 4.5.6 JC-1 荧光染色观察细胞凋亡 | 第79-80页 |
| 4.5.7 MTT 分析细胞增殖 | 第80-81页 |
| 4.5.8 流式细胞仪检测 | 第81-82页 |
| 4.5.9 DNA ladder 检测细胞凋亡 | 第82-83页 |
| 4.5.10 荧光分光光度计检测 Caspase3 活性 | 第83-84页 |
| 4.5.11 SDS-PAGE 检测蛋白的表达 | 第84页 |
| 4.5.12 qRT-PCR 检测稳定转染 pEGFP-RL1 的 Vero 细胞及 PC12 细胞中的 microRNA 表达 | 第84-85页 |
| 4.6 小结 | 第85-88页 |
| 结论与展望 | 第88-90页 |
| 结论 | 第88页 |
| 本论文的创新之处 | 第88页 |
| 展望 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-97页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 附件 | 第99页 |
