| 中文摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 常用英文缩写说明 | 第10-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-28页 |
| 1 副猪嗜血杆菌概述 | 第16-18页 |
| 1.1 HPS病原学及流行病学 | 第16页 |
| 1.2 HPS遗传操作方法 | 第16-18页 |
| 2 细菌自然转化概述 | 第18-25页 |
| 2.1 细菌自然转化能力 | 第18-19页 |
| 2.2 细菌自然转化的功能 | 第19页 |
| 2.3 自然转化过程中外源基因的捕获机制 | 第19-23页 |
| 2.3.1 革兰氏阳性菌外源DNA摄取机制 | 第20-21页 |
| 2.3.2 革兰氏阴性菌外源DNA摄取机制 | 第21-23页 |
| 2.4 自然转化外源基因的内在化过程 | 第23-25页 |
| 2.4.1 同源序列 | 第23-24页 |
| 2.4.2 SOS系统 | 第24页 |
| 2.4.3 错配修复系统 | 第24-25页 |
| 3 ComA功能的研究进展 | 第25-27页 |
| 3.1 ComABCDEF操纵子影响Tfp表型 | 第25页 |
| 3.2 ComA作为孔道蛋白参与外源DNA转运 | 第25-26页 |
| 3.3 ComA作为ATP依赖蛋白参与密度感应 | 第26-27页 |
| 研究目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二部分 实验研究 | 第28-72页 |
| 第一章 HPS自然转化条件的优化及自然感受态的筛选 | 第28-42页 |
| 1 材料 | 第28-30页 |
| 1.1 菌株及质粒载体 | 第28页 |
| 1.2 主要试剂和试剂盒 | 第28-29页 |
| 1.3 培养基和主要试剂的配制 | 第29-30页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第30页 |
| 1.5 引物 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-33页 |
| 2.1 cheY LKR-pK18自杀质粒的大量提取与鉴定 | 第30-31页 |
| 2.1.1 cheY LKR-pK18～DH5a的复苏、纯化 | 第30-31页 |
| 2.1.2 cheY LKR-pK18质粒的大量提取及鉴定 | 第31页 |
| 2.2 自然转化条件的优化及转化频率的测定 | 第31-32页 |
| 2.2.1 细菌点样时生长阶段的优化 | 第31页 |
| 2.2.2 平板点样孵化时间的优化 | 第31页 |
| 2.2.3 转化体系细菌浓度的优化 | 第31-32页 |
| 2.2.4 转化体系外源cAMP浓度的优化 | 第32页 |
| 2.2.5 转化体系外源质粒浓度的优化 | 第32页 |
| 2.2.6 转化后平板孵化时间的优化 | 第32页 |
| 2.3 转化子的鉴定 | 第32-33页 |
| 2.3.1 转化子的培养及基因组的提取 | 第32页 |
| 2.3.2 转化子PCR验证 | 第32-33页 |
| 2.4 数据的统计分析 | 第33页 |
| 2.5 自然感受态的筛选 | 第33页 |
| 3 结果 | 第33-39页 |
| 3.1 cheY LKR-pK18质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2 自然转化的条件优化及转化频率测定 | 第34-38页 |
| 3.2.1 细菌点样时的生长阶段与自然转化频率的关系 | 第34-35页 |
| 3.2.2 平板点样孵化时长与自然转化频率的关系 | 第35页 |
| 3.2.3 转化体系细菌的浓度与自然转化频率的关系 | 第35-37页 |
| 3.2.4 转化体系外源cAMP的浓度与自然转化频率的关系 | 第37页 |
| 3.2.5 转化体系外源质粒的浓度与自然转化频率的关系 | 第37-38页 |
| 3.2.6 转化后平板孵化时间与自然转化频率的关系 | 第38页 |
| 3.3 阳性转化子的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| 3.4 HPS标准株及田间分离株自然感受态筛选结果 | 第39页 |
| 4 讨论 | 第39-41页 |
| 5 小结 | 第41-42页 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌comA基因失活株及互补株的构建 | 第42-61页 |
| 1 材料 | 第42-45页 |
| 1.1 菌株及质粒载体 | 第42页 |
| 1.2 主要试剂和试剂盒 | 第42-43页 |
| 1.3 培养基和主要试剂的配制 | 第43-44页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第44-45页 |
| 1.5 引物 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-53页 |
| 2.1 副猪嗜血杆菌comA基因失活株的构建 | 第45-48页 |
| 2.1.1 融合片段的PCR扩增 | 第45-46页 |
| 2.1.2 自杀质粒和融合片段的酶切纯化 | 第46-47页 |
| 2.1.3 RLcomA-Kan-pK18重组质粒的连接转化 | 第47页 |
| 2.1.4 SC1401菌株comA基因失活株的构建 | 第47-48页 |
| 2.1.5 comA::Kan～SC1401 PCR鉴定 | 第48页 |
| 2.2 副猪嗜血杆菌comA基因互补株的构建 | 第48-50页 |
| 2.2.1 pMC-comA重组质粒的构建 | 第48页 |
| 2.2.2 pMC-cowA ～S17(-1λpir)的构建 | 第48-49页 |
| 2.2.3 SC1401菌株comA基因互补株的构建 | 第49页 |
| 2.2.4 CcomA～SC1401的PCR鉴定 | 第49页 |
| 2.2.5 comA基因失活株及互补株的RT-PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3 comA基因失活株及互补株Western Blotting鉴定 | 第50-53页 |
| 2.3.1 ComA-pET32a重组表达质粒的构建 | 第50-51页 |
| 2.3.2 重组蛋白的初步表达与条件优化 | 第51页 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达与纯化 | 第51-52页 |
| 2.3.4 多克隆抗体的制备 | 第52页 |
| 2.3.5 亲本株、comA基因失活株及互补株的Western blotting鉴定 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-59页 |
| 3.1 RLcomA-Kan-pK18自杀质粒的构建 | 第53页 |
| 3.2 comA::Kan～SC1401的PCR鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3 pMC-comA重组质粒的构建 | 第54-55页 |
| 3.4 CcomA～SC1401的PCR鉴定 | 第55-56页 |
| 3.5 comA基因失活株及互补株的RT-PCR鉴定 | 第56页 |
| 3.6 重组表达质粒的构建 | 第56-57页 |
| 3.7 重组蛋白的表达条件优化 | 第57-58页 |
| 3.8 comA基因失活株及互补株的Western blotting鉴定 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-60页 |
| 5 小结 | 第60-61页 |
| 第三章 亲本株、基因失活株及互补株生物学特性的比较研究 | 第61-72页 |
| 1 材料 | 第61-62页 |
| 1.1 菌株及质粒载体 | 第61页 |
| 1.2 主要试剂和试剂盒 | 第61页 |
| 1.3 培养基和主要试剂的配制 | 第61-62页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第62页 |
| 2 方法 | 第62-64页 |
| 2.1 亲本株、基因失活株及互补株细菌形态的比较 | 第62页 |
| 2.1.1 革兰氏染色观察 | 第62页 |
| 2.1.2 透射电镜观察 | 第62页 |
| 2.2 生长特性的比较 | 第62-63页 |
| 2.3 温度、pH压力试验 | 第63页 |
| 2.4 自凝集试验 | 第63页 |
| 2.5 生物被膜形成试验 | 第63页 |
| 2.6 血清杀菌试验 | 第63-64页 |
| 2.7 自然转化能力的比较 | 第64页 |
| 2.8 数据统计分析 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-69页 |
| 3.1 细菌形态 | 第64-66页 |
| 3.1.1 光学显微镜观察 | 第64-65页 |
| 3.1.2 透射显微镜观察 | 第65-66页 |
| 3.2 生长特性 | 第66页 |
| 3.3 comA失活对HPS高温、酸碱耐受的影响 | 第66-67页 |
| 3.4 ComA对HPS自凝集活性的影响 | 第67页 |
| 3.5 生物被膜形成能力 | 第67-68页 |
| 3.6 抗血清杀菌能力 | 第68-69页 |
| 3.7 自然转化能力 | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 5 小结 | 第71-72页 |
| 第三部分 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 附录 | 第80-85页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第85页 |
