| 中文摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中文文摘 | 第6-12页 |
| 绪论 | 第12-26页 |
| 1 影响蛋白质热稳定性的因素 | 第12-16页 |
| 1.1 疏水相互作用 | 第12页 |
| 1.2 氢键 | 第12-13页 |
| 1.3 盐桥 | 第13-14页 |
| 1.4 二硫键 | 第14页 |
| 1.5 芳香环的相互作用 | 第14-15页 |
| 1.6 稳定的二级结构 | 第15页 |
| 1.7 蛋白质的包装效率 | 第15-16页 |
| 1.8 不稳定区域的锚定 | 第16页 |
| 2 蛋白质热稳定性分析方法 | 第16-18页 |
| 2.1 平板透明圈法 | 第16-17页 |
| 2.2 紫外分光光度法 | 第17页 |
| 2.3 圆二色谱 | 第17页 |
| 2.4 差示热量扫描分析法 | 第17-18页 |
| 3 蛋白质热稳定性突变体(文库)的构建策略 | 第18-20页 |
| 3.1 非理性设计(定向进化)策略 | 第18-19页 |
| 3.2 半理性设计策略 | 第19页 |
| 3.3 理性设计 | 第19-20页 |
| 4 Burkholderia sp.脂肪酶概述和应用 | 第20-24页 |
| 4.1 Burkholderia sp.脂肪酶结构特点 | 第20-21页 |
| 4.2 Burkholderia sp.脂肪酶的应用 | 第21-24页 |
| 5 立题依据和意义 | 第24-26页 |
| 5.1 本课题的研究背景及意义 | 第24页 |
| 5.2 本课题的研究内容 | 第24-26页 |
| 第一章 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶LipA热稳定性突变体电子文库的构建及筛选 | 第26-54页 |
| 1 前言 | 第26页 |
| 2 生物信息学分析软件 | 第26-27页 |
| 3 实验方法 | 第27-51页 |
| 3.1 脂肪酶LipA 3D结构模型的构建与活性中心保护区域氨基酸残基的界定 | 第27-28页 |
| 3.2 FoldX全序列扫描,构建突变电子文库 | 第28-35页 |
| 3.3 Rosetta自由能计算分析,构建突变电子文库 | 第35-40页 |
| 3.4 整合FoldX软件和Rosetta软件预测的潜在突变体电子文库 | 第40-47页 |
| 3.5 利用YASARA软件对突变体结构进行目检,剔除不合理突变 | 第47-51页 |
| 4 小结和讨论 | 第51-54页 |
| 第二章 基于盐桥效应筛选脂肪酶LipA热稳定突变体 | 第54-72页 |
| 1 前言 | 第54页 |
| 2 实验材料 | 第54-58页 |
| 2.1 菌株与载体 | 第54页 |
| 2.2 培养基与溶液 | 第54-56页 |
| 2.3 工具酶、引物及试剂 | 第56-58页 |
| 2.4 主要仪器和设备 | 第58页 |
| 2.5 分析软件 | 第58页 |
| 3 实验方法 | 第58-65页 |
| 3.1 筛选具有盐桥效应的潜在突变体 | 第58-60页 |
| 3.2 YASARA分析具有盐桥效应的突变体 | 第60-61页 |
| 3.3 质粒pACYC-lipA/lipB的提取 | 第61-62页 |
| 3.4 E.coli BL2(DE3)感受态的制备 | 第62页 |
| 3.5 E.coli BL21(DE3)感受态的验证 | 第62-63页 |
| 3.6 脂肪酶lipA基因突变体文库的构建 | 第63-64页 |
| 3.7 脂肪酶lipA基因及其突变体的的诱导表达 | 第64-65页 |
| 3.8 脂肪酶酶活的测定 | 第65页 |
| 3.9 热稳定性提高的脂肪酶突变体的筛选 | 第65页 |
| 3.10 脂肪酶及其突变体T_(50)~(12)和t_(1/2)的测定 | 第65页 |
| 3.11 分子动力学模拟 | 第65页 |
| 4 结果和分析 | 第65-70页 |
| 4.1 突变文库中存在盐桥效应的突变体在3D分子结构模型上的位置 | 第65-66页 |
| 4.2 质粒pACYC-lipA-lipB的提取 | 第66-67页 |
| 4.3 PCR产物纯化 | 第67页 |
| 4.4 突变体的构建及突变效应 | 第67-68页 |
| 4.5 野生型脂肪酶及正效应脂肪酶突变体T_(50)~(12)值的测定 | 第68-69页 |
| 4.6 野生型脂肪酶及正效应脂肪酶突变体t_(1/2)的测定 | 第69页 |
| 4.7 脂肪酶突变体稳定性提高的分子机制分析 | 第69-70页 |
| 5 讨论 | 第70-72页 |
| 第三章 利用叠加突变构建脂肪酶LipA热稳定突变体 | 第72-88页 |
| 1 前言 | 第72页 |
| 2 实验材料 | 第72-74页 |
| 2.1 试剂与酶 | 第72-73页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第73页 |
| 2.3 培养基与主要溶液 | 第73-74页 |
| 2.4 主要实验设备与仪器 | 第74页 |
| 3 实验方法 | 第74-77页 |
| 3.1 质粒pACYC-lipA-lipB的提取 | 第74页 |
| 3.2 E.coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第74页 |
| 3.3 E.coli BL21(DE3)感受态的验证 | 第74-75页 |
| 3.4 双突变体的构建 | 第75-76页 |
| 3.5 脂肪酶LipA和15个双突变脂肪酶粗酶液的制备 | 第76-77页 |
| 3.6 脂肪酶酶活的测定 | 第77页 |
| 3.7 脂肪酶双突变体T_(50)~(12)和t_(1/2)的测定 | 第77页 |
| 4 结果与分析 | 第77-84页 |
| 4.1 热稳定突变体质粒的提取 | 第77-78页 |
| 4.2 PCR产物纯化 | 第78页 |
| 4.3 双突变体的测序结果分析 | 第78-79页 |
| 4.4 野生型脂肪酶及其双突变体T_(50)~(12)值测定 | 第79-81页 |
| 4.5 野生型脂肪酶及其双突变体t_(1/2)的测定 | 第81-82页 |
| 4.6 脂肪酶双突变体稳定性提高的分子机制 | 第82-84页 |
| 5 小结与讨论 | 第84-88页 |
| 第四章 总论与展望 | 第88-90页 |
| 1 结论 | 第88页 |
| 2 展望 | 第88-90页 |
| 附录1 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-102页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第102-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 个人简历 | 第106-110页 |
