| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 英文缩略表 | 第9-10页 |
| 第一部分 文献综述 | 第10-28页 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸概述 | 第10-14页 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的概念 | 第10页 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的生物合成 | 第10-12页 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的生理功能 | 第12-14页 |
| 1.2 脂肪酸去饱和酶的研究概况 | 第14-18页 |
| 1.2.1 脂肪酸去饱和酶简介 | 第14页 |
| 1.2.2 脂肪酸去饱和酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.2.3 脂肪酸去饱和酶的结构 | 第15页 |
| 1.2.4 脂肪酸去饱和酶的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3 真菌产油脂的研究现状 | 第18-20页 |
| 1.3.1 产油微生物的特点 | 第18页 |
| 1.3.2 产油酵母的种类 | 第18页 |
| 1.3.3 培养条件对产油的影响 | 第18-20页 |
| 1.4 脂肪酸去饱和酶的异源表达 | 第20-25页 |
| 1.4.1 表达系统的种类 | 第20页 |
| 1.4.2 大肠杆菌表达系统 | 第20-22页 |
| 1.4.3 酿酒酵母表达系统 | 第22-23页 |
| 1.4.4 毕赤酵母表达系统 | 第23-25页 |
| 1.5 本课题研究的内容和意义 | 第25-28页 |
| 1.5.1 本课题的立题依据 | 第25-26页 |
| 1.5.2 本课题的研究思路 | 第26-27页 |
| 1.5.3 本课题的研究内容 | 第27页 |
| 1.5.4 本课题研究的目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二部分 高产多不饱和脂肪酸的酵母培养基的优化 | 第28-35页 |
| 2.1 引言 | 第28页 |
| 2.2 材料和设备 | 第28-29页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第29页 |
| 2.3 正交试验(Orthogonal Experiment) | 第29-30页 |
| 2.3.1 菌种活化 | 第29页 |
| 2.3.2 正交试验设计 | 第29-30页 |
| 2.4 菌体的收集和处理 | 第30-31页 |
| 2.5 气相色谱分析(Gas Chromatography,GC) | 第31-32页 |
| 2.5.1 样品的预处理 | 第31页 |
| 2.5.2 气相色谱仪的类型及程序 | 第31页 |
| 2.5.3 内标法分析样品脂肪酸的组成及含量 | 第31-32页 |
| 2.6 正交试验和极差分析的结果 | 第32-33页 |
| 2.6.1 正交试验结果 | 第32页 |
| 2.6.2 极差分析结果 | 第32-33页 |
| 2.7 分析和结论 | 第33-35页 |
| 2.7.1 结果分析 | 第33-34页 |
| 2.7.2 小结 | 第34-35页 |
| 第三部分 橘林油脂酵母Δ9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆 | 第35-57页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 材料和设备 | 第35-36页 |
| 3.2.1 菌株 | 第35页 |
| 3.2.2 酶和试剂 | 第35-36页 |
| 3.2.3 培养基和溶液 | 第36页 |
| 3.2.4 仪器和设备 | 第36页 |
| 3.3 实验方法 | 第36-48页 |
| 3.3.1 大型真菌总DNA的抽提(Cenis,1992) | 第36-37页 |
| 3.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第37-38页 |
| 3.3.3 基因组步移(Genome Walking) | 第38-39页 |
| 3.3.4 引物序列 | 第39-40页 |
| 3.3.5 Δ9-和△15-FAD核心片段的克隆 | 第40-41页 |
| 3.3.6 目的片段的回收 | 第41-42页 |
| 3.3.7 目的片段的获取 | 第42页 |
| 3.3.8 基因组步移法(Genome Walking)克隆结构基因的全长序列 | 第42-46页 |
| 3.3.9 逆转录PCR(RT-RCR)克隆目的基因对应的cDNA全长 | 第46-48页 |
| 3.4 结果与分析 | 第48-56页 |
| 3.4.1 橘林油脂酵母总DNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.4.2 降落PCR(Touch-down PCR)获得基因的核心序列 | 第49-50页 |
| 3.4.3 接头PCR(Adaptor-PCR)获得基因片段的侧翼序列 | 第50-51页 |
| 3.4.4 热不对称交错PCR(TAIL-PCR)获得基因片段的侧翼序列 | 第51-52页 |
| 3.4.5 逆转录PCR(RT-PCR)获得cDNA的全长序列 | 第52-53页 |
| 3.4.6 系统进化树 | 第53-54页 |
| 3.4.7 蛋白序列的特征 | 第54页 |
| 3.4.8 蛋白的跨膜结构及疏水性 | 第54-56页 |
| 3.5 小结 | 第56-57页 |
| 第四部分 橘林油脂酵母△15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15的异源表达 | 第57-71页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 实验材料 | 第57-59页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第57-58页 |
| 4.2.2 酶和试剂 | 第58页 |
| 4.2.3 培养基和溶液 | 第58-59页 |
| 4.2.4 仪器和设备 | 第59页 |
| 4.3 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15转化酿酒酵母INVScI | 第59-63页 |
| 4.3.1 重组表达载体pHBM354-lkfad15的构建 | 第59-61页 |
| 4.3.2 原始载体pHBM354与重组载体pHBM354-lkfad15转化酿酒酵母INVScI | 第61-62页 |
| 4.3.3 原始载体pHBM354与重组载体pHBM354-lkfad15的诱导表达 | 第62-63页 |
| 4.4 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfadl5转化毕赤酵母GS115 | 第63-66页 |
| 4.4.1 重组表达载体pHBM906-lkfad15的构建 | 第63-64页 |
| 4.4.2 原始载体pHBM906与重组载体pHBM906-lkfad15转化毕赤酵母GS115 | 第64-66页 |
| 4.4.3 原始载体pHBM906与重组载体pHBM906-lkfad15的高密度诱导表达 | 第66页 |
| 4.5 结果与分析 | 第66-69页 |
| 4.5.1 重组表达载体pHBM354-lkfad15和pHBM906-lkfad15的鉴定 | 第66-67页 |
| 4.5.2 诱导产物的气相色谱分析 | 第67-69页 |
| 4.6 小结 | 第69-71页 |
| 本研究的创新点 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 作者简历 | 第82页 |
