| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第12-20页 |
| 1.1 概述 | 第12页 |
| 1.2 HOG途径参与的压力应激响应 | 第12-16页 |
| 1.2.1 高渗甘油(HOG)信号途径概况 | 第12-14页 |
| 1.2.2 HOG途径控制的基因表达调控 | 第14-15页 |
| 1.2.3 HOG途径控制甘油的转运 | 第15页 |
| 1.2.4 HOG途径控制的甘油的合成代谢调节 | 第15页 |
| 1.2.5 HOG途径与其他信号转导途径的联系 | 第15页 |
| 1.2.6 HOG途径参与了多种压力响应过程 | 第15-16页 |
| 1.3 HOG途径调控以外的细胞耐受机制研究 | 第16-17页 |
| 1.3.1 钙离子(Ca2+)通道与渗透压耐受性 | 第16页 |
| 1.3.2 氨基酸积累与细胞耐受性 | 第16-17页 |
| 1.3.3 海藻糖与细胞耐受性 | 第17页 |
| 1.4 论文的主要研究内容 | 第17-20页 |
| 1.4.1 立体依据和研究意义 | 第17-18页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第18-20页 |
| 第二章 二倍体工业酵母C. glycerinogenes分子操作系统的构建 | 第20-34页 |
| 2.1 前言 | 第20页 |
| 2.2 材料与方法 | 第20-25页 |
| 2.2.1 菌株及培养方法 | 第20-21页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第22页 |
| 2.2.4 C. glycerinogenes基因组DNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.5 常压室温等离子体(ARTP)诱变 | 第22-23页 |
| 2.2.6 尿嘧啶营养缺陷型的验证 | 第23-24页 |
| 2.2.7 C. glycerinogenes的转化方法 | 第24页 |
| 2.2.8 基因敲除载体p HUH的构建 | 第24页 |
| 2.2.9 C. glycerinogenes GPD1基因的敲除 | 第24-25页 |
| 2.2.10 整合表达载体pURGAP的构建及GFP基因的表达 | 第25页 |
| 2.2.11 分析方法 | 第25页 |
| 2.3 结果与分析 | 第25-31页 |
| 2.3.1 ARTP诱变筛选尿嘧啶营养缺陷型突变株 | 第25-26页 |
| 2.3.2 C.glycerinogenes尿嘧啶营养缺陷型突变株的确认 | 第26-27页 |
| 2.3.3 尿嘧啶营养缺陷型突变株U5的表型评估 | 第27-28页 |
| 2.3.4 以URA5为标记构建的整合表达载体 | 第28-29页 |
| 2.3.5 C. glycerinogenes基因敲除载体pHUH的构建 | 第29页 |
| 2.3.6 以GPD1基因为例的二倍体酵母基因敲除 | 第29-31页 |
| 2.4 讨论 | 第31-32页 |
| 2.5 本章小结 | 第32-34页 |
| 第三章C. glycerinogenes HOG途径及其调节的细胞耐受性 | 第34-48页 |
| 3.1 前言 | 第34-35页 |
| 3.2 材料与方法 | 第35-39页 |
| 3.2.1 菌株、质粒及培养方法 | 第35-36页 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器设备 | 第36页 |
| 3.2.3 基因组DNA的提取及质量控制 | 第36-37页 |
| 3.2.4 基因组文库的构建及测序 | 第37页 |
| 3.2.5 基因组序列的拼接和组装 | 第37页 |
| 3.2.6 基因预测和功能注释 | 第37页 |
| 3.2.7 CgHOG1在S. cerevisiae ScHOG1Δ 中互补表达 | 第37页 |
| 3.2.8 C. glycerinogenes HOG1基因的敲除 | 第37-38页 |
| 3.2.9 C. glycerinogenes HOG1基因的回补 | 第38-39页 |
| 3.2.10 Western blotting分析 | 第39页 |
| 3.2.11 数据库及生物信息学工具 | 第39页 |
| 3.2.12 分析方法 | 第39页 |
| 3.3 结果与分析 | 第39-44页 |
| 3.3.1 基于基因组测序获得HOG途径相关基因 | 第39-41页 |
| 3.3.2 HOG途径的核心分子Hog1的功能鉴定 | 第41页 |
| 3.3.3 C. glycerinogenes HOG1基因缺失突变株的构建 | 第41-42页 |
| 3.3.4 HOG1缺失对细胞形态发生的影响 | 第42-43页 |
| 3.3.5 HOG1缺失对C. glycerinogenes细胞耐受性的影响 | 第43-44页 |
| 3.3.6 HOG1缺失对C. glycerinogenes甘油合成的影响 | 第44页 |
| 3.4 讨论 | 第44-46页 |
| 3.5 本章小节 | 第46-48页 |
| 第四章 HOG途径调控的甘油合成对细胞耐受性的影响 | 第48-58页 |
| 4.1 前言 | 第48页 |
| 4.2 材料与方法 | 第48-51页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第48页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第48-49页 |
| 4.2.3 仪器设备 | 第49页 |
| 4.2.4 总RNA的抽提、反转录及实时荧光定量PCR | 第49-50页 |
| 4.2.5 染色质免疫共沉淀 | 第50页 |
| 4.2.6 GPD1在U5和GPD1Δ 中的表达 | 第50-51页 |
| 4.2.7 胞浆 3-磷酸甘油脱氢酶酶活测定 | 第51页 |
| 4.2.8 分析方法 | 第51页 |
| 4.3 结果与分析 | 第51-56页 |
| 4.3.1 渗透压诱导C. glycerinogenes快速积累胞内甘油 | 第51-52页 |
| 4.3.2 基于基因组注释预测的C. glycerinogenes甘油代谢途径 | 第52-53页 |
| 4.3.3 基于ChIP-PCR技术获得部分Hog1调控的靶基因 | 第53-54页 |
| 4.3.4 GPD1缺失对菌株甘油合成的影响 | 第54-55页 |
| 4.3.5 GPD1缺失对菌株压力耐受的影响 | 第55页 |
| 4.3.6 甘油的过量合成对菌株渗透压耐受的影响 | 第55-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-57页 |
| 4.5 本章小节 | 第57-58页 |
| 第五章 HOG途径调控的甘油转运对细胞耐受性的影响 | 第58-70页 |
| 5.1 前言 | 第58页 |
| 5.2 材料与方法 | 第58-62页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第58页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第58-59页 |
| 5.2.3 仪器设备 | 第59页 |
| 5.2.4 甘油转运蛋白基因STL1和STL2的敲除 | 第59-60页 |
| 5.2.5 STL1和STL2在S. cerevisiae ScSTL1Δ 中的互补表达 | 第60页 |
| 5.2.6 STL1和STL2的亚细胞定位及荧光观察 | 第60-61页 |
| 5.2.7 总RNA的抽提、反转录及实时荧光定量PCR | 第61页 |
| 5.2.8 细胞在渗透压下的相对存活率 | 第61-62页 |
| 5.3 结果与分析 | 第62-68页 |
| 5.3.1 额外添加甘油可促进GPD1Δ 在渗透压下的生长 | 第62-63页 |
| 5.3.2 基于基因组测序获得甘油转运蛋白Stl1和Stl2 | 第63页 |
| 5.3.3 Stl1和Stl2的亚细胞定位 | 第63-64页 |
| 5.3.4 STL1和STL2在ScSTL1Δ 中互补表达 | 第64-65页 |
| 5.3.5 敲除STL1和STL2影响了细胞在甘油为底物下的生长 | 第65页 |
| 5.3.6 STL1和STL2的启动子序列分析 | 第65-66页 |
| 5.3.7 STL1和STL2在渗透压下不同的表达特性 | 第66-67页 |
| 5.3.8 STL1和STL2影响了细胞在高渗条件下的生长 | 第67-68页 |
| 5.4 讨论 | 第68-69页 |
| 5.5 本章小结 | 第69-70页 |
| 第六章 基于RNA-Seq研究Hog1调节的氨基酸合成与转运 | 第70-82页 |
| 6.1 前言 | 第70页 |
| 6.2 材料与方法 | 第70-72页 |
| 6.2.1 菌株和生长条件 | 第70页 |
| 6.2.2 实验试剂与仪器设备 | 第70-71页 |
| 6.2.3 总RNA抽提 | 第71页 |
| 6.2.4 文库构建与测序 | 第71页 |
| 6.2.5 序列匹配 | 第71页 |
| 6.2.6 基因表达水平标准化和差异表达基因计算 | 第71-72页 |
| 6.2.7 谷氨酸脱羧酶基因GAD1的过量表达 | 第72页 |
| 6.2.8 胞内氨基酸含量的测定 | 第72页 |
| 6.2.9 实时荧光定量PCR | 第72页 |
| 6.3 结果与分析 | 第72-79页 |
| 6.3.1 RNA-Seq概况 | 第72-73页 |
| 6.3.2 GO功能富集分析 | 第73页 |
| 6.3.3 差异表达基因的初步分析 | 第73-75页 |
| 6.3.4 渗透压诱导的氨基酸合成与转运 | 第75-77页 |
| 6.3.5 渗透压诱导 γ-氨基丁酸透性酶基因的表达 | 第77页 |
| 6.3.6 额外添加 γ-氨基丁酸促进细胞在高渗条件下的生长 | 第77-78页 |
| 6.3.7 过量表达GAD1促进细胞在高渗条件下的生长 | 第78-79页 |
| 6.4 讨论 | 第79-80页 |
| 6.5 本章小结 | 第80-82页 |
| 主要结论和展望 | 第82-84页 |
| 主要结论 | 第82-83页 |
| 展望 | 第83-84页 |
| 论文主要创新点 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 附录I 作者在攻读博士学位期间发表论文 | 第95页 |
