| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第15-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-46页 |
| 1.1 转录组学 | 第17-27页 |
| 1.1.1 转录组学研究概况 | 第17-18页 |
| 1.1.2 转录组学研究方法 | 第18-22页 |
| 1.1.3 原核生物的转录组学研究 | 第22-25页 |
| 1.1.4 芽孢杆菌属的转录组学研究 | 第25-27页 |
| 1.2 芽孢杆菌属的表达元件 | 第27-37页 |
| 1.2.1 芽孢杆菌属中启动子结构 | 第27-31页 |
| 1.2.2 启动子的筛选 | 第31-36页 |
| 1.2.2.1 启动子的预测 | 第31-32页 |
| 1.2.2.2 启动子探针系统 | 第32-34页 |
| 1.2.2.3 构建启动子文库 | 第34-36页 |
| 1.2.3 核糖体结合位点 | 第36-37页 |
| 1.3 鸟苷生产菌的代谢工程研究 | 第37-44页 |
| 1.3.1 鸟苷生产菌 | 第37-38页 |
| 1.3.2 鸟苷的生物合成途径 | 第38-42页 |
| 1.3.3 鸟苷产生菌的代谢工程改造 | 第42-44页 |
| 1.4 本课题的研究意义及主要内容 | 第44-46页 |
| 1.4.1 本课题的研究意义 | 第44-45页 |
| 1.4.2 本课题的研究内容 | 第45-46页 |
| 第二章 基于RNA-seq技术的解淀粉芽孢杆菌转录组学研究 | 第46-76页 |
| 2.1 引言 | 第46页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第46-49页 |
| 2.2.1 主要仪器和设备 | 第46-47页 |
| 2.2.2 菌种和质粒 | 第47页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第47页 |
| 2.2.4 培养基与溶液的配制 | 第47-48页 |
| 2.2.4.1 培养基的配制 | 第47-48页 |
| 2.2.4.2 溶液的配制 | 第48页 |
| 2.2.5 所用引物序列 | 第48-49页 |
| 2.3 实验方法 | 第49-60页 |
| 2.3.1 细菌的培养 | 第49页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌的培养 | 第49页 |
| 2.3.1.2 芽孢杆菌的培养 | 第49页 |
| 2.3.2 质粒的构建 | 第49-54页 |
| 2.3.2.1 pBEP43-bgaB质粒的构建 | 第49-54页 |
| 2.3.2.2 整合质粒pKS2-amyX的构建 | 第54页 |
| 2.3.3 解淀粉芽孢杆菌的转化 | 第54-55页 |
| 2.3.3.1 电击感受态细胞的制备 | 第54页 |
| 2.3.3.2 感受态细胞的电击转化 | 第54-55页 |
| 2.3.4 RNA-seq测序菌株XH7-bgaB的构建 | 第55-56页 |
| 2.3.5 RNA-seq样品的制备 | 第56-57页 |
| 2.3.6 cDNA建库及测序 | 第57-58页 |
| 2.3.7 测序数据的组装和拼接 | 第58页 |
| 2.3.8 基因表达水平及标准化 | 第58-59页 |
| 2.3.8.1 基因表达水平 | 第58-59页 |
| 2.3.8.2 基因表达水平的标准化 | 第59页 |
| 2.3.9 RNA-seq数据的生物信息学分析 | 第59页 |
| 2.3.10 RT-qPCR验证RNA-seq数据的分析结果 | 第59-60页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第60-74页 |
| 2.4.1 RNA样品的制备与分析 | 第60-62页 |
| 2.4.2 解淀粉芽孢杆菌RNA-Seq数据的概述 | 第62-63页 |
| 2.4.3 解淀粉芽孢杆菌全基因组水平的转录分析 | 第63-65页 |
| 2.4.4 RT-qPCR验证分析RNA-Seq数据 | 第65-66页 |
| 2.4.5 基因转录起始位点和转录终止位点的研究 | 第66-67页 |
| 2.4.6 操纵子结构的研究 | 第67-68页 |
| 2.4.7 与鸟苷代谢相关途径的分析 | 第68-74页 |
| 2.5 本章小结 | 第74-76页 |
| 第三章 解淀粉芽孢杆菌表达元件的挖掘 | 第76-101页 |
| 3.1 引言 | 第76页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第76-83页 |
| 3.2.1 主要仪器和设备 | 第76-77页 |
| 3.2.2 菌种和质粒 | 第77-79页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第79-80页 |
| 3.2.4 培养基与溶液的配制 | 第80-81页 |
| 3.2.4.1 培养基的配制 | 第80页 |
| 2.2.4.2 溶液的配制 | 第80-81页 |
| 3.2.5 所用引物序列 | 第81-83页 |
| 3.3 实验方法 | 第83-90页 |
| 3.3.1 菌体的培养 | 第83页 |
| 3.3.1.1 大肠杆菌的培养 | 第83页 |
| 3.3.1.2 解淀粉芽孢杆菌的培养 | 第83页 |
| 3.3.2 质粒的构建 | 第83-84页 |
| 3.3.2.1 表达质粒的构建 | 第83-84页 |
| 3.3.2.2 启动子探针质粒pBE-bgaB的构建 | 第84页 |
| 3.3.3 筛选启动子 | 第84-87页 |
| 3.3.4 筛选的启动子序列分析和生物信息学分析 | 第87页 |
| 3.3.5 启动子的亚克隆 | 第87-88页 |
| 3.3.6 芽孢杆菌的转化 | 第88页 |
| 3.3.7 蛋白样品制备与SDS-PAGE电泳检测 | 第88-90页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第90-100页 |
| 3.4.1 基于RNA-Seq数据筛选强启动子研究 | 第90-93页 |
| 3.4.1.1 强启动子分类及活性鉴定分析 | 第90-92页 |
| 3.4.1.2 筛选的强启动子的表达运用研究 | 第92-93页 |
| 3.4.2 启动子探针质粒筛选启动子研究 | 第93-100页 |
| 3.4.2.1 启动子探针质粒的构建情况 | 第93-94页 |
| 3.4.2.2 具有 β-半乳糖苷酶活性转化子的筛选研究 | 第94-96页 |
| 3.4.2.3 筛选的强启动子在解淀粉芽孢杆菌中的 β-Gal活力研究 | 第96-97页 |
| 3.4.2.4 筛选的P41强启动子的序列分析 | 第97-98页 |
| 3.4.2.5 P41启动子的RBS位点优化研究 | 第98-100页 |
| 3.5 本章小结 | 第100-101页 |
| 第四章 嘌呤操纵子表达元件的基因工程改造研究 | 第101-126页 |
| 4.1 引言 | 第101页 |
| 4.2 实验仪器和材料 | 第101-105页 |
| 4.2.1 主要仪器设备 | 第101-102页 |
| 4.2.2 菌种和质粒 | 第102页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第102-103页 |
| 4.2.4 培养基与溶液的配制 | 第103-104页 |
| 4.2.4.1 培养基的配制 | 第103页 |
| 4.2.4.2 溶液的配制 | 第103-104页 |
| 4.2.5 所用引物序列 | 第104-105页 |
| 4.3 实验方法 | 第105-112页 |
| 4.3.1 解淀粉芽孢杆菌的摇瓶发酵 | 第105页 |
| 4.3.2 嘌呤操纵子启动子 5’-UTR截断载体的构建 | 第105-106页 |
| 4.3.3 嘌呤启动子替换质粒的构建 | 第106-108页 |
| 4.3.4 嘌呤启动子表达载体的构建 | 第108页 |
| 4.3.5 解淀粉芽孢杆菌转化株的敲除过程 | 第108-109页 |
| 4.3.6 解淀粉芽孢杆菌转化株的筛选与鉴定 | 第109-110页 |
| 4.3.7 发酵液中鸟苷产量的测定 | 第110页 |
| 4.3.8 发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第110页 |
| 4.3.9 发酵液中菌体干重的测定 | 第110页 |
| 4.3.10 发酵液中胞内物质的测定 | 第110-111页 |
| 4.3.11 发酵过程中RNA的提取与检测 | 第111页 |
| 4.3.12 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测 | 第111-112页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第112-124页 |
| 4.4.1 解淀粉芽孢杆菌嘌呤操纵子的启动子结构分析 | 第112页 |
| 4.4.2 嘌呤操纵子启动子 5’-UTR截短载体的构建情况 | 第112-114页 |
| 4.4.3 嘌呤启动子替换载体的构建情况 | 第114-116页 |
| 4.4.4 嘌呤启动子表达载体的构建情况 | 第116-117页 |
| 4.4.5 嘌呤操纵子启动子活性的比较分析 | 第117-118页 |
| 4.4.6 解淀粉芽孢杆菌的转化及工程菌的鉴定分析 | 第118-120页 |
| 4.4.6.1 5’-UTR截短工程菌的获得及鉴定分析 | 第118-119页 |
| 4.4.6.2 嘌呤启动子替换工程菌的获得及鉴定分析 | 第119-120页 |
| 4.4.7 工程菌的鸟苷摇瓶发酵情况 | 第120-121页 |
| 4.4.8 工程菌的胞内物质的检测分析 | 第121-123页 |
| 4.4.9 工程菌发酵过程中嘌呤操纵子的表达研究 | 第123-124页 |
| 4.5 本章小结 | 第124-126页 |
| 第五章 解淀粉芽孢杆菌呼吸链的基因工程改造研究 | 第126-139页 |
| 5.1 引言 | 第126-127页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第127-128页 |
| 5.2.1 主要仪器设备 | 第127页 |
| 5.2.2 菌种和质粒 | 第127页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第127页 |
| 5.2.4 培养基与溶液配制 | 第127-128页 |
| 5.2.4.1 培养基的配制 | 第127-128页 |
| 5.2.4.2 溶液的配制 | 第128页 |
| 5.2.5 所用引物序列 | 第128页 |
| 5.3 实验方法 | 第128-131页 |
| 5.3.1 解淀粉芽孢杆菌的培养 | 第128页 |
| 5.3.2 cyd操纵子敲除载体pKS2-cyd的构建 | 第128-129页 |
| 5.3.3 解淀粉芽孢杆菌的转化 | 第129页 |
| 5.3.4 解淀粉芽孢杆菌△cyd工程菌的构建 | 第129页 |
| 5.3.5 解淀粉芽孢杆菌△cyd工程菌的筛选与鉴定 | 第129页 |
| 5.3.6 发酵液中鸟苷含量的测定 | 第129页 |
| 5.3.7 发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第129页 |
| 5.3.8 发酵液中菌体干重的测定 | 第129页 |
| 5.3.9 发酵液中有机酸的测定 | 第129-130页 |
| 5.3.10 工程菌遗传稳定性实验 | 第130-131页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第131-138页 |
| 5.4.1 cyd操纵子敲除质粒的构建情况 | 第131-132页 |
| 5.4.2 解淀粉芽孢杆菌工程菌的鉴定分析 | 第132-134页 |
| 5.4.3 cyd基因工程菌的鸟苷摇瓶发酵情况 | 第134-136页 |
| 5.4.4 发酵液中有机酸的含量分析 | 第136-137页 |
| 5.4.5 工程菌传代稳定性研究 | 第137-138页 |
| 5.5 本章小结 | 第138-139页 |
| 总结和展望 | 第139-142页 |
| 总结 | 第139-140页 |
| 本论文创新之处 | 第140-141页 |
| 展望 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-157页 |
| 附录 | 第157-169页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第169-170页 |
| 致谢 | 第170-171页 |
| 附件 | 第171页 |
