| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 缩略语 | 第8-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-20页 |
| 1 杆状病毒表达系统概述 | 第12-14页 |
| 1.1 杆状病毒表达系统介绍 | 第12页 |
| 1.2 杆状病毒极晚期基因启动子的研究 | 第12-14页 |
| 2 酵母单杂交系统简介 | 第14-17页 |
| 2.1 酵母单杂交技术的原理 | 第14-16页 |
| 2.2 酵母单杂交系统的优点 | 第16页 |
| 2.3 酵母单杂交系统的应用 | 第16-17页 |
| 3 报告基因荧光素酶简介 | 第17-20页 |
| 3.1 荧光素酶的种类及性质 | 第17-18页 |
| 3.2 荧光素酶的反应原理 | 第18-19页 |
| 3.3 荧光素酶的应用 | 第19-20页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第20-23页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第20页 |
| 2 研究的主要内容 | 第20-22页 |
| 3 实验流程图 | 第22-23页 |
| 第三章 利用酵母单杂交系统筛选BmNPV多角体基因启动子结合蛋白 | 第23-47页 |
| 1 实验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第23-24页 |
| 1.1.1 菌株 | 第23页 |
| 1.1.2 载体 | 第23-24页 |
| 1.2 试剂 | 第24-26页 |
| 1.2.1 试剂盒 | 第24页 |
| 1.2.2 酶 | 第24页 |
| 1.2.3 引物 | 第24-25页 |
| 1.2.4 培养基 | 第25页 |
| 1.2.5 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-38页 |
| 2.1 重组诱饵质粒的构建 | 第26-30页 |
| 2.1.1 一步PCR扩增目的片段 | 第26-27页 |
| 2.1.2 PCR产物与pMD 18-T载体进行连接 | 第27页 |
| 2.1.3 用CaCl_2法将连接产物转化大肠杆菌TG1菌株 | 第27-28页 |
| 2.1.4 重组质粒pMD 18-T-3r和pMD 18-T-3m的筛选与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.1.5 重组质粒p3r-AbAi和突变重组质粒p3m-AbAi的构建和鉴定 | 第29-30页 |
| 2.1.6 重组质粒p3r-AbAi和p3m-AbAi的测序分析 | 第30页 |
| 2.2 酵母诱饵报告子的构建 | 第30-33页 |
| 2.2.1 重组诱饵质粒的Bbs Ⅰ单酶切 | 第30页 |
| 2.2.2 酵母感受态细胞制备 | 第30-31页 |
| 2.2.3 线性化诱饵质粒转化酵母感受态细胞 | 第31页 |
| 2.2.4 酵母诱饵报告子PCR鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.5 酵母诱饵报告子的AbA~r最小抑制浓度测定 | 第32-33页 |
| 2.3 酵母单杂交系统cDNA AD融合表达文库(eDNA AD fusion library)的构建 | 第33-36页 |
| 2.3.1 感染BmNPV第5天的家蚕五龄幼虫脂肪体组织总RNA的提取 | 第33页 |
| 2.3.2 家蚕脂肪体组织mRNA的纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.3 家蚕脂肪体组织mRNA的浓缩 | 第34页 |
| 2.3.4 cDNA第一链的合成 | 第34-35页 |
| 2.3.5 利用长距离PCR(long distance-PCR,LD-PCR)合成SMART双链cDNA | 第35-36页 |
| 2.3.6 SMART双链cDNA的纯化 | 第36页 |
| 2.4 利用酵母单杂交系统筛选多角体基因启动子结合蛋白 | 第36-37页 |
| 2.5 阳性克隆的鉴定并进行测序分析 | 第37-38页 |
| 3 实验结果 | 第38-44页 |
| 3.1 一步PCR法合成目的基因的鉴定 | 第38页 |
| 3.2 重组质粒pMD 18-T-3r和pMD 18-T-3m的鉴定 | 第38-39页 |
| 3.3 重组质粒p3r-AbAi和p3m-AbAi的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.4 酵母单杂交系统筛选cDNA文库的构建 | 第40-41页 |
| 3.5 酵母诱饵报告子的PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 3.6 酵母诱饵报告子的AbA~r抗性测定 | 第42-43页 |
| 3.7 利用酵母单杂交系统对cDNA AD融合表达文库进行筛选 | 第43-44页 |
| 3.8 家蚕五龄幼虫脂肪体组织cDNA文库的筛选 | 第44页 |
| 4 讨论 | 第44-47页 |
| 第三章 蛋白结合因子的生物信息学分析 | 第47-56页 |
| 1 生物信息学工具 | 第47页 |
| 2 RPSA基因和DBP基因的生物信息学分析 | 第47-55页 |
| 2.1 RPSA和DBP的基因序列分析 | 第47-49页 |
| 2.2 疏水性分析 | 第49-50页 |
| 2.3 信号肽分析 | 第50-52页 |
| 2.4 跨膜区分析 | 第52-53页 |
| 2.5 二级结构预测 | 第53页 |
| 2.6 RPSA和DBP基因的同源性分析 | 第53-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 第四章 RPSA和DBP的RNAi分析 | 第56-63页 |
| 1. 材料与试剂 | 第56页 |
| 1.1 材料 | 第56页 |
| 1.2 试剂 | 第56页 |
| 2 方法 | 第56-60页 |
| 2.1 dsRNA的合成 | 第56-58页 |
| 2.1.1 合成体外转录模板 | 第57-58页 |
| 2.1.2 体外转录RNA | 第58页 |
| 2.1.3 dsRNA浓度的测定 | 第58页 |
| 2.2 RNAi---dsRNA的转染 | 第58-59页 |
| 2.3 重组病毒Bacmid-Luc的感染 | 第59-60页 |
| 2.4 萤火虫荧光素酶活性的检测 | 第60页 |
| 3 实验结果 | 第60-62页 |
| 3.1 dsRNA的合成 | 第60-61页 |
| 3.2 RPSA和DBP基因的RNAi结果分析 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 第五章 RPSA和DBP的瞬时表达分析 | 第63-72页 |
| 1 材料与试剂 | 第63页 |
| 1.1 材料 | 第63页 |
| 1.2 试剂 | 第63页 |
| 2 方法 | 第63-68页 |
| 2.1 瞬时表达载体pSK-IE-RPSA、pSK-IE-DBP的构建 | 第63-66页 |
| 2.2 瞬时表达质粒转染家蚕BmN细胞 | 第66-67页 |
| 2.3 家蚕BmN细胞的感染 | 第67页 |
| 2.4 萤火虫荧光素酶活性的检测 | 第67-68页 |
| 3 结论 | 第68-71页 |
| 3.1 PCR扩增目的基因RPSA和DBP | 第68-69页 |
| 3.2 重组质粒pSK-IE-RPSA和pSK-IE-DBP的鉴定 | 第69-70页 |
| 3.3 RPSA和DBP基因的瞬时表达结果分析 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-72页 |
| 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
