| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 绪论 | 第8-17页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第8-9页 |
| 1.2 脂肪酶的应用 | 第9-11页 |
| 1.2.1 脂肪酶在食品中的应用 | 第9页 |
| 1.2.2 脂肪酶在医药中的应用 | 第9-10页 |
| 1.2.3 脂肪酶在洗涤剂中的应用 | 第10页 |
| 1.2.4 脂肪酶在皮革中的应用 | 第10页 |
| 1.2.5 脂肪酶在生物柴油生产中的应用 | 第10-11页 |
| 1.2.6 脂肪酶在生物传感器中的应用 | 第11页 |
| 1.3 脂肪酶的结构及催化机理 | 第11页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达载体 | 第11-12页 |
| 1.4.2 外源基因转化与整合 | 第12页 |
| 1.5 全基因合成 | 第12-14页 |
| 1.5.1 全基因合成方法学进展 | 第13-14页 |
| 1.6 解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的研究进展 | 第14-16页 |
| 1.7 本课题研究目的及意义 | 第16-17页 |
| 2 实验材料与方法 | 第17-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-20页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 酶及生化试剂 | 第17页 |
| 2.1.3 培养基及所用溶液 | 第17-19页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第19-20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-36页 |
| 2.2.1 Y. lipolytica lipase解脂耶氏脂肪酶基因lip2的克隆和毕赤酵母工程菌的构建 | 第20-22页 |
| 2.2.2 新型脂肪酶基因的设计，合成和重组构建 | 第22-23页 |
| 2.2.3 PFLD1启动子的克隆和重组子的构建 | 第23-25页 |
| 2.2.4 毕赤酵母系统重组子的构建 | 第25-26页 |
| 2.2.5 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| 2.2.6 毕赤酵母的电转化 | 第27页 |
| 2.2.7 重组工程菌的筛选及验证 | 第27-29页 |
| 2.2.8 重组工程菌的摇瓶发酵 | 第29-31页 |
| 2.2.9 PichiaPink表达产物糖基化位点的预测和内切糖苷酶对糖基化位点的酶切 | 第31页 |
| 2.2.10 重组子在台式发酵罐中的发酵 | 第31-32页 |
| 2.2.11 毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化 | 第32-34页 |
| 2.2.12 细胞鲜重，脂肪酶活性和蛋白质含量的测定 | 第34-35页 |
| 2.2.13 发酵过程中发酵上清液的脂肪酶酶活力测定 | 第35页 |
| 2.2.14 发酵过程中发酵上清液的SDS-PAGE | 第35-36页 |
| 3 结果与讨论 | 第36-51页 |
| 3.1 人工合成基因的设计与合成 | 第36-41页 |
| 3.2 天然基因与合成基因之间脂肪酶的表达比较与分析 | 第41-42页 |
| 3.3 不同启动子类型之间脂肪酶表达的比较与分析 | 第42-43页 |
| 3.4 不同毕赤酵母表达系统之间脂肪酶表达的比较与分析 | 第43-46页 |
| 3.5 最适PH | 第46页 |
| 3.6 最适温度 | 第46-48页 |
| 3.7 讨论 | 第48-51页 |
| 3.7.1 影响外源基因在毕赤酵母中高效表达的原因 | 第48-49页 |
| 3.7.2 基因的拷贝数 | 第49页 |
| 3.7.3 启动子对Lip2表达的影响 | 第49页 |
| 3.7.4 信号肽对Lip2表达的影响 | 第49-51页 |
| 4 结论 | 第51-52页 |
| 5 参考文献 | 第52-59页 |
| 6 致谢 | 第59-60页 |
| 附录 | 第60-61页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第61页 |
