| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 背景 | 第11-28页 |
| 1.1 丝状真菌的背景介绍 | 第11-13页 |
| 1.2 曲霉的转化 | 第13-19页 |
| 1.2.1 米曲霉的营养缺陷型筛选标记 | 第13-14页 |
| 1.2.2 米曲霉的抗药型筛选标记 | 第14-15页 |
| 1.2.3 曲霉的转化 | 第15-17页 |
| 1.2.4 曲霉的转化特点 | 第17-19页 |
| 1.3 米曲霉基因组信息的研究 | 第19-21页 |
| 1.4 表达系统的构建 | 第21-26页 |
| 1.4.1 米曲霉启动子的发掘和功能研究 | 第21-24页 |
| 1.4.2 表达载体的构建 | 第24-26页 |
| 1.5 α-淀粉酶在真菌的表达 | 第26-27页 |
| 1.6 本课题立题依据及目标 | 第27-28页 |
| 第2章 米曲霉野生型宿主表达系统的建立及同源淀粉酶的表达 | 第28-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-34页 |
| 2.1.1 菌种及质粒 | 第28页 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 | 第28-31页 |
| 2.1.3 培养基配方 | 第31-32页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第32-33页 |
| 2.1.5 主要实验仪器 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-43页 |
| 2.2.1 野生型米曲霉RIB40的抗性标记的筛选 | 第34页 |
| 2.2.2 表达载体的改造 | 第34-37页 |
| 2.2.2.1 重复酶切位点的定点突变 | 第34-35页 |
| 2.2.2.2 冗余序列的切除 | 第35-37页 |
| 2.2.3 博来霉素抗性基因的克隆 | 第37页 |
| 2.2.4 启动子的筛选 | 第37-39页 |
| 2.2.5 米曲霉野生型宿主表达系统的建立 | 第39-40页 |
| 2.2.5.1 原生质体的制备方法 | 第39页 |
| 2.2.5.2 野生型宿主的原生质体转化 | 第39-40页 |
| 2.2.6 米曲霉RIB40α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第40-42页 |
| 2.2.6.1 总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.2.6.2 合成第一链反转录cDNA | 第41页 |
| 2.2.6.3 a-淀粉酶基因克隆与分析 | 第41-42页 |
| 2.2.7 米曲霉RIB40α-淀粉酶基因(amyB)在米曲霉中的表达 | 第42-43页 |
| 2.2.7.1 米曲霉amyB基因曲霉重组表达载体的构建 | 第42页 |
| 2.2.7.2 米曲霉amyB基因在RIB40中的高效表达 | 第42-43页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第43-52页 |
| 2.3.1 野生型米曲霉抗性标记的筛选及转化方法的建立 | 第43-44页 |
| 2.3.2 表达载体的改造 | 第44-45页 |
| 2.3.2.1 重复酶切位点的定点突变 | 第44-45页 |
| 2.3.2.2 冗余序列的切除 | 第45页 |
| 2.3.3 博来霉素抗性基因的克隆 | 第45页 |
| 2.3.4 菌体培养及原生质体的制备 | 第45-48页 |
| 2.3.5 启动子的筛选 | 第48-49页 |
| 2.3.6 米曲霉RIB40α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第49-50页 |
| 2.3.7 米曲霉amyB基因曲霉重组表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.3.8 米曲霉amyB基因在RIB40中的高效表达 | 第51-52页 |
| 2.4 小结 | 第52-53页 |
| 第3章 米曲霉营养缺陷型表达系统的建立及异源蛋白的表达 | 第53-67页 |
| 3.1 实验材料 | 第53-56页 |
| 3.1.1 菌种菌种及质粒 | 第53页 |
| 3.1.2 工具酶和试剂 | 第53页 |
| 3.1.3 培养基配方 | 第53-55页 |
| 3.1.4 引物设计 | 第55-56页 |
| 3.2 实验方法 | 第56-60页 |
| 3.2.1 紫外诱变法筛选米曲霉pyrG营养缺陷型菌株 | 第56-57页 |
| 3.2.2 应用于pyrG营养缺陷型表达载体的改造及构建 | 第57页 |
| 3.2.3 绿色荧光蛋白表达载体的构建及转化 | 第57-59页 |
| 3.2.4 脂肪酶基因表达载体的构建及转化 | 第59-60页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第60-65页 |
| 3.3.1 紫外诱变法筛选米曲霉pyrG营养缺陷型菌株 | 第60-61页 |
| 3.3.2 应用于pyrG营养缺陷型菌株的表达载体的构建 | 第61-63页 |
| 3.3.3 绿色荧光蛋白表达载体的构建及表达 | 第63-65页 |
| 3.3.3.1 增强型绿色荧光蛋白及表达载体的构建 | 第63页 |
| 3.3.3.2 增强型绿色荧光蛋白EGFP在米曲霉中的异源表达 | 第63-65页 |
| 3.3.4 脂肪酶lipase表达载体的构建及表达 | 第65页 |
| 3.3.4.1 脂肪酶lipase基因表达载体的构建及转化 | 第65页 |
| 3.3.4.2 脂肪酶Lipase在米曲霉中异源表达 | 第65页 |
| 3.4 小结 | 第65-67页 |
| 第4章 产黄青霉α-淀粉酶基因在米曲霉中的异源表达 | 第67-80页 |
| 4.1 实验材料 | 第67-69页 |
| 4.1.1 菌种菌种及质粒 | 第67页 |
| 4.1.2 工具酶和试剂 | 第67页 |
| 4.1.3 培养基配方 | 第67-68页 |
| 4.1.4 实验所用引物 | 第68-69页 |
| 4.2 实验方法 | 第69-73页 |
| 4.2.1 产α-淀粉酶的青霉(Penicillium sp.)的菌种鉴定 | 第69页 |
| 4.2.2 温度和pH对青霉(Penicillium sp.)α-淀粉酶的影响 | 第69-70页 |
| 4.2.3 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第70页 |
| 4.2.4 重组产黄青霉α-淀粉酶质粒的构建 | 第70-72页 |
| 4.2.5 产黄青霉α-淀粉酶基因在米曲霉中的异源表达和纯化 | 第72页 |
| 4.2.6 产黄青霉α-淀粉酶的Western blot检测 | 第72-73页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第73-79页 |
| 4.3.1 青霉的菌种鉴定和α-淀粉酶基因的克隆 | 第73-75页 |
| 4.3.2 温度和pH对青霉(Penicillium sp.)α-淀粉酶的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.3 重组产黄青霉α-淀粉酶质粒的构建 | 第76-77页 |
| 4.3.4 产黄青霉PcAmy在米曲霉中的异源表达 | 第77-78页 |
| 4.3.5 产黄青霉PcAmy的纯化 | 第78-79页 |
| 4.4 小结 | 第79-80页 |
| 第5章 结论与展望 | 第80-81页 |
| 5.1 总结 | 第80页 |
| 5.2 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
