| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 背景介绍 | 第8-16页 |
| 1.1 全细胞检测金属离子发展背景 | 第8-9页 |
| 1.2 毕赤酵母简要介绍 | 第9-11页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表面展示系统 | 第9页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表面展示系统的应用 | 第9-11页 |
| 1.3 锚定蛋白介绍 | 第11-14页 |
| 1.3.1 Pir1家族介绍 | 第11页 |
| 1.3.2 其他锚定蛋白及其应用 | 第11-14页 |
| 1.4 目的蛋白GolB简要介绍 | 第14-15页 |
| 1.5 本文的研究工作 | 第15-16页 |
| 2 实验材料 | 第16-30页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第16页 |
| 2.2 主要试剂 | 第16页 |
| 2.3 培养基与主要试剂成分 | 第16-19页 |
| 2.4 主要仪器 | 第19-20页 |
| 2.5 实验方法 | 第20-30页 |
| 2.5.1 引物设计 | 第20-21页 |
| 2.5.1.1 设计锚定蛋白Pirl的特异性扩增引物 | 第20页 |
| 2.5.1.2 设计目标蛋白GolB的特异性扩增引物 | 第20-21页 |
| 2.5.1.3 设计AOX引物 | 第21页 |
| 2.5.2 反应体系 | 第21-24页 |
| 2.5.2.1 普通PCR反应扩增体系 | 第21页 |
| 2.5.2.2 菌落PCR扩增体系 | 第21-22页 |
| 2.5.2.3 PCR反应程序 | 第22页 |
| 2.5.2.4 EcoRⅠ/NotⅠ切割pPICZαA | 第22页 |
| 2.5.2.5 EcoRⅠ/NotⅠ切割Pirl PCR产物 | 第22-23页 |
| 2.5.2.6 EcoRⅠ/NdeⅠ切割pPICZαA-Pir1 | 第23页 |
| 2.5.2.7 EcoRⅠ/NdeⅠ切割GolB PCR产物 | 第23页 |
| 2.5.2.8 SacⅠ线性化pPICZaA-GolB-Pir1 | 第23页 |
| 2.5.2.9 DNA连接 | 第23-24页 |
| 2.5.2.10 Pirl与pPICZ-(EcoRⅠ/NotⅠ)的连接 | 第24页 |
| 2.5.2.11 GolB与pPICZaa-Pir1(EcoRⅠ/NdeⅠ)的连接 | 第24页 |
| 2.5.3 实验步骤 | 第24-30页 |
| 2.5.3.1 连接产物的大肠杆菌转化 | 第24-25页 |
| 2.5.3.2 大肠杆菌感受态的制备 | 第25页 |
| 2.5.3.3 质粒pPICZαA或重组质粒pPICZaA-Pir1的小量提取 | 第25-26页 |
| 2.5.3.4 重组质粒pPICZαA-GolB-Pir1的中量提取 | 第26页 |
| 2.5.3.5 DNA凝胶回收 | 第26-27页 |
| 2.5.3.6 酵母转化 | 第27页 |
| 2.5.3.7 酵母基因组提取 | 第27-28页 |
| 2.5.3.8 免疫荧光与FACS | 第28页 |
| 2.5.3.9 重组酵母的表达 | 第28-29页 |
| 2.5.3.10 不同浓度金离子吸附检测 | 第29页 |
| 2.5.3.11 混合贵重金属离子吸附检测 | 第29页 |
| 2.5.3.12 透射电镜分析 | 第29-30页 |
| 2.5.3.13 重组酵母耐受性实验 | 第30页 |
| 3 实验结果 | 第30-44页 |
| 3.1 重组质粒的构建 | 第30-33页 |
| 3.1.1 重组质粒pPICZαA-Pirl构建示意图 | 第30-31页 |
| 3.1.2 重组质粒pPICZαA-Pirl的构建过程 | 第31-33页 |
| 3.2 重组质粒pPICZaA-GolB-Pir1的构建 | 第33-36页 |
| 3.2.1 重组质粒pPICZoA-GolB-Pir1构建示意图 | 第33-34页 |
| 3.2.2 重组质粒pPICZoA-GolB-Pir1构建过程 | 第34-36页 |
| 3.3 重组质粒pPICZoA-GolB-Pir1的线性化 | 第36-37页 |
| 3.4 重组酵母GS115的验证 | 第37-39页 |
| 3.5 流式检测确认目的蛋白GolB的表面表达 | 第39-40页 |
| 3.6 免疫荧光确认目的蛋白GolB的表面表达 | 第40-41页 |
| 3.7 贵重金属离子吸附检测 | 第41-42页 |
| 3.8 透射电子显微镜观察实验 | 第42-43页 |
| 3.9 重组酵母对金离子的耐受性 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-45页 |
| 5 本章小结 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 硕士在读期间论文发表情况 | 第51-52页 |
