| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 英文缩写词 | 第8-13页 |
| 1 前言 | 第13-26页 |
| 1.1 养猪业的重要性 | 第13页 |
| 1.2 IGF1基因的研究进展 | 第13-18页 |
| 1.2.1 IGF1的研究历史 | 第13-14页 |
| 1.2.2 IGF1基因的结构及定位 | 第14页 |
| 1.2.3 IGF1基因的生物学功能 | 第14-15页 |
| 1.2.3.1 IGF1促生长作用 | 第14-15页 |
| 1.2.3.2 IGF1对胚胎发育的作用 | 第15页 |
| 1.2.4 IGF1基因的表达量 | 第15-16页 |
| 1.2.5 IGF1基因的多态性 | 第16-17页 |
| 1.2.6 IGF1的调控 | 第17-18页 |
| 1.2.6.1 IGFBPs的调控 | 第17-18页 |
| 1.2.6.2 激素对IGF1的调控 | 第18页 |
| 1.3 Poly(dA:dT) tract的研究进展 | 第18-22页 |
| 1.3.1 Poly(dA:dT) tracts在体内的重要功能 | 第18-19页 |
| 1.3.2 Poly(dA:dT) tracts在体内排斥核小体 | 第19-20页 |
| 1.3.3 Poly(dA:dT) tracts拥有不寻常的结构与动态特性 | 第20-22页 |
| 1.4 转录因子C/EBPα的研究进展 | 第22-25页 |
| 1.4.1 C/EBPs的研究历史 | 第22-24页 |
| 1.4.2 C/EBPα的调控机理 | 第24-25页 |
| 1.5 研究目的及意义 | 第25页 |
| 1.6 本研究的技术路线 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-31页 |
| 2.1.1 供试样品 | 第26页 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 | 第26-27页 |
| 2.1.3 主要试剂来源和配制 | 第27-30页 |
| 2.1.3.1 酶类、试剂和试剂盒 | 第27页 |
| 2.1.3.2 试剂的配置 | 第27-30页 |
| 2.1.4 细胞株、菌株和质粒 | 第30页 |
| 2.1.5 主要分子生物学软件与数据库 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-52页 |
| 2.2.1 基因组DNA和总RNA抽提 | 第31-33页 |
| 2.2.1.1 基因组DNA的抽提 | 第31页 |
| 2.2.1.2 总RNA抽提 | 第31-32页 |
| 2.2.1.3 总RNA的DNase-Ⅰ处理 | 第32页 |
| 2.2.1.4 总RNA检测及浓度测定 | 第32-33页 |
| 2.2.2 总RNA反转录 | 第33页 |
| 2.2.3 猪IGF1基因 5′调控区克隆 | 第33-38页 |
| 2.2.3.1 猪IGF1基因 5′调控区扩增 | 第34页 |
| 2.2.3.2 目的片段的回收和纯化 | 第34-36页 |
| 2.2.3.3 目的片段的T载体克隆 | 第36-37页 |
| 2.2.3.4 T-IGF1的质粒抽提 | 第37-38页 |
| 2.2.4 猪IGF1基因启动子报告基因重组体的构建及活性分析 | 第38-44页 |
| 2.2.4.1 启动子 5′端系列缺失报告基因重组体的构建 | 第38-40页 |
| 2.2.4.2 猪IGF1基因缺失片段的PCR扩增 | 第40页 |
| 2.2.4.3 各缺失片段PCR产物的回收 | 第40页 |
| 2.2.4.4 缺失片段PCR产物和pGL3-basic载体双酶切 | 第40-41页 |
| 2.2.4.5 酶切产物回收 | 第41页 |
| 2.2.4.6 酶切产物的连接 | 第41页 |
| 2.2.4.7 酶切连接产物的转化 | 第41页 |
| 2.2.4.8 无内毒素质粒抽提方法 | 第41-42页 |
| 2.2.4.9 各重组质粒纯化与检测 | 第42页 |
| 2.2.4.10 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立 | 第42-43页 |
| 2.2.4.11 瞬时转染 | 第43-44页 |
| 2.2.4.12 荧光素酶报告基因活性检测 | 第44页 |
| 2.2.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体的构建及活性分析 | 第44-45页 |
| 2.2.5.1 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的报告基因重组体的构建 | 第44页 |
| 2.2.5.2 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子片段的PCR扩增 | 第44-45页 |
| 2.2.5.3 各启动子片段PCR产物的回收 | 第45页 |
| 2.2.5.4 各启动子片段PCR产物和pGL3-basic载体双酶切 | 第45页 |
| 2.2.5.5 酶切产物回收 | 第45页 |
| 2.2.5.6 酶切产物的连接 | 第45页 |
| 2.2.5.7 酶切连接产物的转化 | 第45页 |
| 2.2.5.8 无内毒素质粒抽提 | 第45页 |
| 2.2.5.9 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立 | 第45页 |
| 2.2.5.10 瞬时转染 | 第45页 |
| 2.2.5.11 荧光素酶报告基因活性检测 | 第45页 |
| 2.2.6 猪IGF1基因相关转录因子鉴定 | 第45-52页 |
| 2.2.6.1 C/EBPα超表达载体的构建 | 第45-52页 |
| 2.2.6.1.1 引物设计及合成 | 第45-46页 |
| 2.2.6.1.2 目的片段的回收和纯化 | 第46页 |
| 2.2.6.1.3 PCR产物和pcDNA3.1 载体双酶切 | 第46页 |
| 2.2.6.1.4 酶切产物的回收 | 第46页 |
| 2.2.6.1.5 酶切产物的连接 | 第46页 |
| 2.2.6.1.6 酶切连接产物的转化 | 第46-47页 |
| 2.2.6.1.7 无内毒素质粒抽提 | 第47页 |
| 2.2.6.1.8 猪胎儿成纤维细胞体外培养体系的建立 | 第47页 |
| 2.2.6.1.9 pcDNA3.1- C/EBPα与含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5报告基因重组体共转染 | 第47页 |
| 2.2.6.1.10 超表达后mRNA水平的检测 | 第47-48页 |
| 2.2.6.1.11 定量结果的数据分析处理 | 第48页 |
| 2.2.6.1.12 C/EBPα干扰实验 | 第48-49页 |
| 2.2.6.1.13 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第49-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-64页 |
| 3.1 DNA提取结果 | 第52-53页 |
| 3.2 总RNA提取结果 | 第53页 |
| 3.3 猪IGF15′调控区序列获得 | 第53-54页 |
| 3.4 猪IGF1基因启动子报告基因重组体的构建及活性分析 | 第54-58页 |
| 3.4.1 猪IGF1基因启动子转录因子结合位点的预测 | 第54-55页 |
| 3.4.2 启动子报告基因重组体的构建 | 第55页 |
| 3.4.3 猪原代胎儿成纤维细胞的培养 | 第55-57页 |
| 3.4.4 启动子活性分析 | 第57-58页 |
| 3.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心启动子的活性分析 | 第58页 |
| 3.6 猪IGF1基因核转录因子鉴定 | 第58-64页 |
| 3.6.1 C/EBPα超表达载体构建 | 第58-59页 |
| 3.6.2 pcDNA3.1-C/EBPα与含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5报告基因重组体共转染 | 第59-60页 |
| 3.6.3 pcDNA3.1-C/EBPα的超表达 | 第60-61页 |
| 3.6.4 C/EBPα干扰实验 | 第61-63页 |
| 3.6.5 IGF1基因启动子ChIP检测结果 | 第63-64页 |
| 4 讨论与结论 | 第64-77页 |
| 4.1 IGF1基因对动物机体的作用 | 第64页 |
| 4.2 猪IGF1基因 5′调控区序列的获得 | 第64-65页 |
| 4.3 猪IGF1基因启动子活性分析 | 第65-68页 |
| 4.3.1 猪IGF1基因 5′调控区重要调控元件分析 | 第65-67页 |
| 4.3.2 猪IGF1基因启动子活性分析 | 第67-68页 |
| 4.4 Poly(dA:dT) tract对IGF1基因的调控 | 第68-71页 |
| 4.5 C/EBPα对IGF1基因的调控 | 第71-73页 |
| 4.6 Poly(dA:dT) tract对C/EBPα调控IGF1基因的影响 | 第73-75页 |
| 4.7 结论 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-92页 |
| 附录 | 第92-93页 |
