| 中文摘要 | 第3-5页 |
| 英文摘要 | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第12-14页 |
| 1 绪论 | 第14-36页 |
| 1.1 国内外研究现状及文献综述 | 第15-31页 |
| 1.1.1 Nrf1结构与功能 | 第15-25页 |
| 1.1.2 上皮间质细胞转化(EMT) | 第25-28页 |
| 1.1.3 PI3K/AKT信号通路的调控 | 第28-31页 |
| 1.2 课题研究目的及研究内容 | 第31-36页 |
| 1.2.1 课题研究目的与意义 | 第31-32页 |
| 1.2.2 课题研究内容 | 第32页 |
| 1.2.3 课题创新之处 | 第32-34页 |
| 1.2.4 课题研究技术路线 | 第34-36页 |
| 2 Nrf1α/TCF11在肝癌细胞中的差异表达 | 第36-56页 |
| 2.1 引言 | 第36页 |
| 2.2 实验材料、试剂与仪器 | 第36-40页 |
| 2.2.1 实验细胞株、质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.2 仪器与设备 | 第37页 |
| 2.2.3 主要实验试剂 | 第37-40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-50页 |
| 2.3.1 实验用细胞的培养、接种、冻存及复苏 | 第40-41页 |
| 2.3.2 细胞总RNA提取及定量RT-PCR检测Nrf1 mRNA表达水平 | 第41-43页 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取及TaqMan Assays分析Nrf1α/TCF11的差异表达 | 第43-45页 |
| 2.3.4 细胞总蛋白收集及Western blot检测Nrf1蛋白表达水平 | 第45-47页 |
| 2.3.5 Nrf1α/TCF11 CDS区域的克隆、质粒构建及测序鉴定 | 第47-50页 |
| 2.3.6 数据处理与统计学分析 | 第50页 |
| 2.4 结果分析 | 第50-54页 |
| 2.4.1 不同细胞Nrf1的差异表达 | 第50-51页 |
| 2.4.2 不同细胞Nrf1α/TCF11的差异表达 | 第51-54页 |
| 2.5 讨论 | 第54-55页 |
| 2.6 本章小结 | 第55-56页 |
| 3 TALEN/慢病毒系统细胞平台的构建 | 第56-84页 |
| 3.1 引言 | 第56-57页 |
| 3.2 实验材料与试剂 | 第57-58页 |
| 3.2.1 细胞与试剂 | 第57页 |
| 3.2.2 仪器设备 | 第57-58页 |
| 3.3 实验方法 | 第58-69页 |
| 3.3.1 TALEN技术 | 第58-59页 |
| 3.3.2 靶向Nrf1α 的TALEN质粒构建及鉴定 | 第59-61页 |
| 3.3.3 靶向Nrf1α 的TALEN质粒活性检测 | 第61-64页 |
| 3.3.4 TALEN介导Nrf1α 同源双敲除细胞（HepG2）的建立 | 第64-65页 |
| 3.3.5 慢病毒技术 | 第65-66页 |
| 3.3.6 Nrf1慢病毒RNA干扰与Nrf1α 超表达质粒的构建及鉴定 | 第66-67页 |
| 3.3.7 慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 | 第67-68页 |
| 3.3.8 慢病毒转染HepG2细胞与TALEN细胞 | 第68页 |
| 3.3.9 TALEN细胞和慢病毒转染细胞Nrf1差异表达检测 | 第68-69页 |
| 3.3.10 免疫荧光染色 | 第69页 |
| 3.3.11 数据处理与统计学分析 | 第69页 |
| 3.4 实验结果 | 第69-81页 |
| 3.4.1 靶向Nrf1α 的TALEN质粒构建及鉴定 | 第69-72页 |
| 3.4.2 靶向Nrf1α 的TALEN质粒活性检测 | 第72-73页 |
| 3.4.3 TALEN介导Nrf1α 同源双敲除细胞（HepG2）的建立 | 第73-76页 |
| 3.4.4 Nrf1慢病毒RNA干扰与Nrf1α 超表达质粒的构建及鉴定 | 第76-77页 |
| 3.4.5 重组慢病毒滴度的确定 | 第77-78页 |
| 3.4.6 重组慢病毒转染HepG2细胞与TALEN细胞 | 第78-79页 |
| 3.4.7 Nrf1蛋白免疫荧光染色 | 第79-81页 |
| 3.5 讨论 | 第81-82页 |
| 3.6 本章小结 | 第82-84页 |
| 4 调控Nrf1α 表达对肝癌细胞生物学行为的影响 | 第84-96页 |
| 4.1 引言 | 第84页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第84页 |
| 4.3 实验方法 | 第84-86页 |
| 4.3.1 SEM观察细胞形态 | 第84页 |
| 4.3.2 MTS法检测细胞增殖能力 | 第84-85页 |
| 4.3.3 软琼脂平板克隆形成实验 | 第85页 |
| 4.3.4 细胞划痕法检验细胞迁移能力 | 第85-86页 |
| 4.3.5 Transwell检测细胞跨膜迁移能力 | 第86页 |
| 4.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡能力 | 第86页 |
| 4.3.7 数据处理与统计学分析 | 第86页 |
| 4.4 实验结果 | 第86-93页 |
| 4.4.1 Nrf1α 缺失改变肝癌细胞形态 | 第86-88页 |
| 4.4.2 Nrf1α 缺失影响肝癌细胞增殖能力 | 第88-89页 |
| 4.4.3 Nrf1α 缺失调控肝癌细胞迁移能力 | 第89-92页 |
| 4.4.4 Nrf1α 缺失改变细胞凋亡能力 | 第92-93页 |
| 4.5 讨论 | 第93-94页 |
| 4.6 本章小结 | 第94-96页 |
| 5 调控Nrf1α 表达对肝癌细胞转移机制的研究 | 第96-116页 |
| 5.1 引言 | 第96页 |
| 5.2 实验材料试剂 | 第96-97页 |
| 5.2.1 细胞与动物 | 第96页 |
| 5.2.2 试剂与材料 | 第96-97页 |
| 5.3 实验方法 | 第97-100页 |
| 5.3.1 细胞大规模培养及接种 | 第97页 |
| 5.3.2 动物饲养及实验分组 | 第97-98页 |
| 5.3.3 移植瘤体积监测 | 第98页 |
| 5.3.4 收集标本与预处理 | 第98页 |
| 5.3.5 临床HCC病例收集与处理 | 第98页 |
| 5.3.6 SABC法免疫组织化学 | 第98-99页 |
| 5.3.7 细胞组织总RNA提取及定量RT-PCR实验 | 第99页 |
| 5.3.8 细胞组织总蛋白收集及western实验 | 第99页 |
| 5.3.9 数据处理与统计学分析 | 第99-100页 |
| 5.4 结果分析 | 第100-112页 |
| 5.4.1 Nrf1α 缺失促进裸鼠皮下移植瘤恶性增殖并发肝脏转移 | 第100-102页 |
| 5.4.2 Nrf1α缺失7T导致细胞周期与凋亡相关基因异常表达7T | 第102-105页 |
| 5.4.3 Nrf1α缺失7T导致细胞行为相关基因异常表达7T | 第105-108页 |
| 5.4.4 人源肝癌细胞系和肝癌组织Nrf17T的异常7T表达 | 第108-112页 |
| 5.5 讨论 | 第112-115页 |
| 5.6 本章小结 | 第115-116页 |
| 6 初探Nrf1α 调控肝癌细胞恶性转化的分子网络 | 第116-134页 |
| 6.1 引言 | 第116页 |
| 6.2 实验材料 | 第116-117页 |
| 6.3 实验方法 | 第117-120页 |
| 6.3.1 RNA-Sequencing样品准备 | 第117页 |
| 6.3.2 RNA-Sequencing数据采集与分析 | 第117-118页 |
| 6.3.3 基因启动子区域分析及ARE位点质粒构建 | 第118-119页 |
| 6.3.4 双荧光素酶活性分析 | 第119-120页 |
| 6.3.5 总RNA提取及定量RT-PCR分析 | 第120页 |
| 6.3.6 总蛋白收集及western分析 | 第120页 |
| 6.3.7 Nrf1调控肝癌细胞恶性转化分子网络的构建 | 第120页 |
| 6.3.8 数据处理与统计学分析 | 第120页 |
| 6.4 实验结果 | 第120-130页 |
| 6.4.1 RNA-Sequencing数据采集分析 | 第120-125页 |
| 6.4.2 启动子双荧光素酶活性检测 | 第125-127页 |
| 6.4.3 Nrf1α 参与调控PTEN/PI3K/AKT介导的分子网络 | 第127-129页 |
| 6.4.4 Nrf1调控肝癌细胞恶性转化分子网络的构建 | 第129-130页 |
| 6.5 讨论 | 第130-132页 |
| 6.6 本章小结 | 第132-134页 |
| 7 全文总结 | 第134-138页 |
| 7.1 全文讨论 | 第134-136页 |
| 7.2 全文结论 | 第136-137页 |
| 7.3 后续研究工作与展望 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138-140页 |
| 参考文献 | 第140-152页 |
| 附录 | 第152-160页 |
| A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录 | 第152页 |
| B. 作者在攻读学位期间参加科研项目情况 | 第152-153页 |
| C. TALEN识别模块标准序列 | 第153-154页 |
| D. 实时定量PCR引物序列表 | 第154-156页 |
| E. 启动子ARE位点引物序列表 | 第156-160页 |
| F. 启动子ARE位点突变引物序列表 | 第160页 |
