| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-22页 |
| 1.1 甾体化合物概述 | 第10-11页 |
| 1.1.1 甾体化合物结构与功能 | 第10页 |
| 1.1.2 甾体化合物的种类和功能 | 第10-11页 |
| 1.2 甾体化合物的微生物转化 | 第11-15页 |
| 1.2.1 甾体化合物微生物研究进展 | 第11页 |
| 1.2.2 甾体化合物微生物转化特点 | 第11-12页 |
| 1.2.3 微生物羟基化反应原理 | 第12-13页 |
| 1.2.4 甾体化合物微生物转化的类型 | 第13页 |
| 1.2.5 甾体微生物11α-羟基化反应 | 第13-15页 |
| 1.3 常见外源表达系统 | 第15-16页 |
| 1.3.1 大肠表达系统 | 第15页 |
| 1.3.2 酵母表达系统 | 第15-16页 |
| 1.3.3 丝状真菌 | 第16页 |
| 1.4 黑曲霉简介 | 第16-18页 |
| 1.4.1 黑曲霉的生理特征 | 第16-17页 |
| 1.4.2 黑曲霉的应用 | 第17页 |
| 1.4.3 黑曲霉研究进展 | 第17-18页 |
| 1.5 黑曲霉基因敲除技术概述 | 第18-19页 |
| 1.5.1 传统的同源重组技术 | 第18页 |
| 1.5.2 RNA干扰(RNAi)技术 | 第18-19页 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9技术 | 第19页 |
| 1.6 黑曲霉遗传转化方法 | 第19-20页 |
| 1.6.1 原生质体PEG-CaCl_2介导法 | 第19页 |
| 1.6.2 电激转化法 | 第19-20页 |
| 1.6.3 农杆菌介导转化法 | 第20页 |
| 1.7 本论文研究内容及意义 | 第20-22页 |
| 1.7.1 本论文研究内容 | 第20页 |
| 1.7.2 研究意义 | 第20-22页 |
| 2 材料方法 | 第22-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-27页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 工具酶和实验试剂 | 第22-24页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第24-25页 |
| 2.1.4 主要溶液及缓冲液 | 第25-27页 |
| 2.1.5 培养基及抗生素 | 第27页 |
| 2.2 试验方法 | 第27-43页 |
| 2.2.1 黑曲霉孢子悬液制备、培养方法 | 第27-28页 |
| 2.2.2 甾体底物转化投料方法 | 第28页 |
| 2.2.3 转化产物硅胶薄层层析(TLC)、高压液相谱分析(HPLC)方法 | 第28页 |
| 2.2.4 潮霉素B及博来霉素对黑曲霉最小抑制浓度的确定 | 第28页 |
| 2.2.5 黑曲霉基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法 | 第29-30页 |
| 2.2.7 大肠杆菌中质粒提取方法 | 第30-31页 |
| 2.2.8 小量DNA片段的纯化回收方法: | 第31-32页 |
| 2.2.9 酶切产物的胶回收方法 | 第32页 |
| 2.2.10 农杆菌感受态细胞的制备及其电转化方法 | 第32-33页 |
| 2.2.11 农杆菌介导的黑曲霉高效转化方法的探索及优化 | 第33-35页 |
| 2.2.12 敲除载体pPZP-KCYP65的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.13 敲除菌株的构建及筛选(甾体羟化酶基因黑曲霉表达宿主的构建) | 第37-38页 |
| 2.2.14 回补载体的构建 | 第38-40页 |
| 2.2.15 回补突变株的构建 | 第40-42页 |
| 2.2.17 表达宿主适用甾体羟化酶基因的底物谱分析 | 第42-43页 |
| 3 实验结果与讨论 | 第43-60页 |
| 3.1 潮霉素B、博来霉素对黑曲霉最小抑制浓度的确定 | 第43-44页 |
| 3.2 农杆菌介导的黑曲霉高效转化方法的探索及优化 | 第44-47页 |
| 3.2.1 农杆菌菌种对转化效率的影响 | 第44-45页 |
| 3.2.2 黑曲霉孢子浓度对转化率的影响 | 第45页 |
| 3.2.3 转移膜类型对转化率的影响 | 第45-46页 |
| 3.2.4 共培养温度对转化率的影响 | 第46-47页 |
| 3.3 敲除载体的构建 | 第47-49页 |
| 3.3.1 CYP65左、右同源臂的扩增 | 第47页 |
| 3.3.2 载体骨架pPZP以及筛选标记潮霉素B抗性基因(HYG)片段的获得 | 第47-48页 |
| 3.3.3 敲除载体pPZP-KCYP65的构建 | 第48-49页 |
| 3.4 敲除菌株的构建(即表达宿主的构建) | 第49-53页 |
| 3.4.1 敲除载体电转入农杆菌 | 第49-50页 |
| 3.4.2 农杆菌介导的黑曲霉CYP65基因敲除菌株构建 | 第50-53页 |
| 3.5 回补载体的构建 | 第53-55页 |
| 3.5.1 CYP65基因的扩增 | 第53页 |
| 3.5.2 载体骨架pPZP以及筛选标记博来霉素抗性基因(ble)片段的获得 | 第53-54页 |
| 3.5.3 敲除载体pPZP-KCYP65的构建 | 第54-55页 |
| 3.6 回补菌株的构建 | 第55-59页 |
| 3.6.1 回补载体电转入农杆菌 | 第55-56页 |
| 3.6.2 农杆菌介导的黑曲霉CYP65基因回补菌株构建 | 第56-59页 |
| 3.7 表达宿主适用甾体羟化酶基因对应底物谱 | 第59-60页 |
| 4 结论 | 第60-61页 |
| 5 展望 | 第61-62页 |
| 6 参考文献 | 第62-69页 |
| 7 论文发表情况 | 第69-70页 |
| 8 致谢 | 第70页 |
