| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 马铃薯Y病毒及其基因组结构 | 第13-14页 |
| 1.2 植物抗病毒基因工程 | 第14-15页 |
| 1.3 基因沉默 | 第15-22页 |
| 1.3.1 小干扰RNA | 第16-17页 |
| 1.3.2 微小RNA | 第17-18页 |
| 1.3.3 人工microRNA | 第18-20页 |
| 1.3.4 多sRNA策略与植物病毒抗性 | 第20-22页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第22-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-47页 |
| 2.1 材料 | 第24页 |
| 2.1.1 毒源 | 第24页 |
| 2.1.2 植物材料 | 第24页 |
| 2.1.3 所需的菌株、质粒、pre-miRNA | 第24页 |
| 2.1.4 实验试剂 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-47页 |
| 2.2.1 siRNA、amiRNA植物重组表达载体构建 | 第24-32页 |
| 2.2.1.1 siRNA、amiRNA植物重组表达载体的构建策略 | 第24-25页 |
| 2.2.1.2 引物的设计 | 第25页 |
| 2.2.1.3 PCR扩增目的片段 | 第25-26页 |
| 2.2.1.4 dsRNA的合成 | 第26页 |
| 2.2.1.5 试剂盒法DNA片段胶回收 | 第26-27页 |
| 2.2.1.6 目的片段与质粒DNA的酶切 | 第27页 |
| 2.2.1.7 目的片段与质粒DNA的连接 | 第27-28页 |
| 2.2.1.8 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第28页 |
| 2.2.1.9 重组质粒热激法转化大肠杆菌 | 第28-29页 |
| 2.2.1.10 农杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.2.1.11 重组质粒冷冻法转化农杆菌 | 第29-30页 |
| 2.2.1.12 碱性SDS法大提质粒 | 第30-31页 |
| 2.2.1.13 重组质粒的酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.2 PVY-LUC-NIb植物表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 2.2.2.1 目的片段PVY-NIb的PCR扩增 | 第32页 |
| 2.2.2.2 利用试剂盒法回收目的片段 | 第32页 |
| 2.2.2.3 碱性SDS法大提质粒 | 第32页 |
| 2.2.2.4 质粒与目的片段酶切 | 第32页 |
| 2.2.2.5 冻融法重组表达载体向农杆菌中的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.2.6 转化农杆菌后菌落PCR鉴定 | 第33页 |
| 2.2.2.7 农杆菌转化的质粒提取与酶切鉴定 | 第33页 |
| 2.2.3 农杆菌介导的瞬时共表达 | 第33页 |
| 2.2.3.1 农杆菌瞬时侵染本生烟 | 第33页 |
| 2.2.3.2 试剂盒法检测荧光素酶表达量 | 第33页 |
| 2.2.4 转基因烟草的培育 | 第33-34页 |
| 2.2.5 CTAB法小提烟草的总DNA | 第34-35页 |
| 2.2.6 转基因烟草植株的PCR鉴定 | 第35页 |
| 2.2.7 Northern blot分析T_0代转基因植株sRNA表达量 | 第35-39页 |
| 2.2.7.1 热酚法提取植物siRNA、miRNA | 第35-36页 |
| 2.2.7.2 siRNA电泳 | 第36页 |
| 2.2.7.3 siRNA转膜 | 第36-37页 |
| 2.2.7.4 探针制备 | 第37页 |
| 2.2.7.5 DIG标记有效性检测 | 第37-38页 |
| 2.2.7.6 杂交 | 第38-39页 |
| 2.2.8 对转基因植株进行抗性鉴定及ELISA检测 | 第39-40页 |
| 2.2.8.1 抗性鉴定 | 第39页 |
| 2.2.8.2 ELISA检测病毒含量 | 第39-40页 |
| 2.2.9 mRNA的Northern杂交 | 第40-41页 |
| 2.2.9.1 烟草 RNA 的提取（Trizol 法） | 第40页 |
| 2.2.9.2 RNA电泳 | 第40-41页 |
| 2.2.9.3 转膜 | 第41页 |
| 2.2.9.4 杂交 | 第41页 |
| 2.2.10 Southern杂交分析 | 第41-44页 |
| 2.2.10.1 CTAB法大量提取植物总DNA | 第41-42页 |
| 2.2.10.2 植物总DNA的酶切 | 第42页 |
| 2.2.10.3 总DNA凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.10.4 转膜 | 第43页 |
| 2.2.10.5 探针标记 | 第43页 |
| 2.2.10.6 DIG标记有效性检测 | 第43页 |
| 2.2.10.7 杂交 | 第43-44页 |
| 2.2.11 荧光定量PCR | 第44-45页 |
| 2.2.11.1 miRNA反转录 | 第44-45页 |
| 2.2.11.2 miRNA荧光定量 | 第45页 |
| 2.2.12 T_1代遗传分析 | 第45-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-63页 |
| 3.1 靶序列的确定 | 第47页 |
| 3.2 dsRNA的获得与pre-miRNA319a中目的序列的替换 | 第47-48页 |
| 3.3 植物表达载体的构建 | 第48-50页 |
| 3.3.1 植物表达载体的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.2 植物重组表达载体的酶切鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4 sRNA对靶基因的剪切效率的分析 | 第50-53页 |
| 3.4.1 PVY-NIb-LUC载体构建及鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4.2 植物重组表达载体与PVY-NIb-LUC瞬时共侵染本生烟 | 第51-53页 |
| 3.5 转基因烟草的获得及验证 | 第53-54页 |
| 3.5.1 转基因烟草的获得 | 第53页 |
| 3.5.2 转基因烟草PCR检测 | 第53-54页 |
| 3.6 转基因烟草中sRNA的表达量检测 | 第54-55页 |
| 3.7 转基因烟草抗病性分析 | 第55-60页 |
| 3.7.1 T_0代转基因烟草PVY抗性鉴定 | 第55-58页 |
| 3.7.2 转基因烟草Northern blot分析 | 第58-59页 |
| 3.7.3 转基因烟草Southern blot分析 | 第59-60页 |
| 3.8 T_1转基因植株的遗传稳定性检测 | 第60-63页 |
| 4 讨论 | 第63-66页 |
| 5 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
