| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 英文缩略语表 | 第18-20页 |
| 第一篇 文献综述 | 第20-62页 |
| 第一章 无乳链球菌致病性研究进展 | 第20-46页 |
| 1 病原学 | 第20-21页 |
| 2 流行病学 | 第21页 |
| 3 毒力因子的调控及作用机制 | 第21-30页 |
| ·穿孔毒素 | 第21-22页 |
| ·促进免疫逃避的因子 | 第22-24页 |
| ·抵抗宿主抗菌肽的因子 | 第24-25页 |
| ·黏附和侵袭宿主细胞 | 第25-28页 |
| ·其它毒力因子 | 第28-30页 |
| 4 致病机制 | 第30页 |
| 5 无乳链球菌在巨噬细胞内的存活 | 第30-33页 |
| ·无乳链球菌在巨噬细胞内持续存活 | 第30-31页 |
| ·无乳链球菌逃避巨噬细胞杀伤的机制 | 第31页 |
| ·无乳链球菌诱导巨噬细胞凋亡 | 第31-32页 |
| ·抵抗吞噬体内的抗菌环境 | 第32-33页 |
| 6 总结 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-46页 |
| 第二章 细菌基因差异表达研究技术进展 | 第46-62页 |
| 1 基因芯片技术 | 第46-47页 |
| 2 mRNA差异显示技术 | 第47页 |
| 3 体内表达技术 | 第47-48页 |
| 4 代表性差异分析技术 | 第48页 |
| 5 抑制差减杂交技术 | 第48-49页 |
| 6 信号标签诱变技术 | 第49页 |
| 7 差异荧光诱导技术 | 第49页 |
| 8 转录序列的选择性捕获技术 | 第49-55页 |
| ·转录序列的选择性捕获技术的原理 | 第50页 |
| ·SCOTS同其它技术的比较 | 第50-52页 |
| ·SCOTS的应用 | 第52-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 第二篇 试验研究 | 第62-184页 |
| 第三章 无乳链球菌与巨噬细胞和脑血管内皮细胞的相互作用 | 第62-82页 |
| 1 材料与方法 | 第63-67页 |
| ·质粒、菌株和细胞 | 第63页 |
| ·保存及培养条件 | 第63页 |
| ·主要试剂、仪器和耗材 | 第63-64页 |
| ·巨噬细胞吞噬试验 | 第64-65页 |
| ·巨噬细胞胞内存活试验 | 第65页 |
| ·三株无乳链球菌对脑微血管内皮细胞的侵袭 | 第65-66页 |
| ·细胞毒性检测 | 第66-67页 |
| 2 结果 | 第67-73页 |
| ·荧光显微镜观察 | 第67-68页 |
| ·巨噬细胞吞噬GD201008-001试验 | 第68页 |
| ·三株无乳链球菌吞噬率的比较 | 第68-69页 |
| ·三株无乳链球菌在巨噬细胞内的存活试验 | 第69-70页 |
| ·三株无乳链球菌对脑微血管内皮细胞的侵袭 | 第70页 |
| ·三株无乳链球菌对RAW264.7和bEnd.3的毒性 | 第70-72页 |
| ·GD201008-001培养上清对RAW264.7和bEnd.3的毒性 | 第72页 |
| ·吞噬菌对巨噬细胞的细胞毒性 | 第72-73页 |
| 3 讨论 | 第73-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 第四章 SCOTS筛选鱼源无乳链球菌染小鼠巨噬细胞的差异转录基因 | 第82-116页 |
| 1 材料与方法 | 第83-95页 |
| ·细胞系、菌株和质粒 | 第83页 |
| ·工具酶和试剂 | 第83页 |
| ·主要仪器 | 第83-84页 |
| ·引物设计 | 第84-85页 |
| ·无乳链球菌GD201008-001基因组DNA的提取 | 第85-86页 |
| ·无乳链球菌GD201008-001基因组的生物素标记 | 第86页 |
| ·无乳链球菌GD201008-001rDNA的扩增 | 第86页 |
| ·无乳链球菌GD201008-001rDNA的扩增产物连接pMD19-T vector | 第86-87页 |
| ·生物素标记的GD201008-001基因组DNA和rDNA重组质粒的破碎 | 第87页 |
| ·GD201008-001感染RAW264.7及样品的采集 | 第87页 |
| ·总RNA的提取 | 第87-88页 |
| ·双链cDNA的合成 | 第88-90页 |
| ·双链cDNA的扩增和回收 | 第90页 |
| ·选择性捕获转录序列(SCOTS) | 第90-93页 |
| ·SCOTS克隆的PCR鉴定 | 第93页 |
| ·斑点杂交筛选阳性克隆 | 第93-94页 |
| ·阳性SCOTS克隆的测序和分析 | 第94页 |
| ·实时定量PCR验证差异表达的基因 | 第94-95页 |
| 2 结果 | 第95-105页 |
| ·GD201008-001基因组的提取 | 第95页 |
| ·GD201008-001 rDNA的扩增及克隆载体的构建 | 第95-96页 |
| ·GD201008-001基因组DNA及rDNA重组质粒的破碎结果 | 第96-97页 |
| ·双链cDNA的PCR扩增 | 第97页 |
| ·SCOTS结果 | 第97-98页 |
| ·差异转录基因的克隆 | 第98-99页 |
| ·斑点杂交筛选 | 第99-100页 |
| ·差异转录基因的Real-time RT-PCR验证 | 第100-101页 |
| ·差异转录基因的分类和功能注释 | 第101-105页 |
| 3 讨论 | 第105-109页 |
| 参考文献 | 第109-116页 |
| 第五章 差异转录基因缺失株和互补株的构建 | 第116-136页 |
| 1 材料和方法 | 第116-123页 |
| ·菌株和质粒 | 第117页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第117页 |
| ·基因敲除质粒的构建 | 第117-118页 |
| ·基因互补质粒的构建 | 第118-120页 |
| ·GD201008-001感受态的制备 | 第120页 |
| ·电转化 | 第120-121页 |
| ·基因缺失株的构建 | 第121-122页 |
| ·互补株的构建 | 第122页 |
| ·缺失株和互补株的实时定量PCR验证 | 第122-123页 |
| ·遗传稳定性分析和形态学观察比较 | 第123页 |
| ·生长曲线的测定 | 第123页 |
| 2 结果 | 第123-130页 |
| ·缺失基因上下游同源臂的融合PCR | 第123-124页 |
| ·基因敲除质粒的构建 | 第124-125页 |
| ·基因缺失株的PCR鉴定 | 第125-128页 |
| ·互补质粒的构建 | 第128页 |
| ·qRT-PCR验证缺失株及互补株 | 第128-129页 |
| ·遗传稳定性分析和生长形态的比较 | 第129页 |
| ·生长曲线的测定 | 第129-130页 |
| 3 讨论 | 第130-132页 |
| 参考文献 | 第132-136页 |
| 第六章 无乳链球菌感染小鼠巨噬细胞差异转录基因缺失株的生物学特性分析 | 第136-164页 |
| 1 材料与方法 | 第137-142页 |
| ·菌株、细胞系和引物 | 第137-138页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第138页 |
| ·aroA缺失株荚膜的显微镜观察 | 第138页 |
| ·巨噬细胞吞噬试验 | 第138页 |
| ·巨噬细胞内存活试验 | 第138页 |
| ·酸应激和氧化应激的敏感性试验 | 第138-139页 |
| ·脑微血管内皮细胞黏附试验 | 第139页 |
| ·细胞毒性试验 | 第139页 |
| ·细菌胞外产物的活性 | 第139-140页 |
| ·斑马鱼及小鼠的半数致死量测定 | 第140-141页 |
| ·小鼠组织细菌载量测定 | 第141页 |
| ·细胞因子的检测 | 第141-142页 |
| 2 结果 | 第142-154页 |
| ·荚膜的显微镜观察 | 第142-143页 |
| ·RAW264.7吞噬试验 | 第143-144页 |
| ·各菌株在RAW264.7中的存活 | 第144页 |
| ·各菌株在酸应激或氧化应激环境中的存活 | 第144-146页 |
| ·各菌株对bEnd.3的黏附 | 第146-147页 |
| ·细胞毒性试验 | 第147-149页 |
| ·胞外产物的活性 | 第149-150页 |
| ·半数致死量的测定 | 第150-152页 |
| ·小鼠组织细菌载量的测定 | 第152-153页 |
| ·细胞因子的检测 | 第153-154页 |
| 3 讨论 | 第154-158页 |
| 参考文献 | 第158-164页 |
| 第七章 无乳链球菌aroA缺失株小鼠免疫效果评价 | 第164-184页 |
| 1 材料与方法 | 第165-170页 |
| ·菌株 | 第165页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第165页 |
| ·试验动物 | 第165页 |
| ·疫苗的制备 | 第165-166页 |
| ·ΔaroA单次免疫剂量的筛选 | 第166页 |
| ·ΔaroA单次免疫对不同攻毒剂量的保护性 | 第166页 |
| ·免疫程序 | 第166-167页 |
| ·血清IgG抗体水平检测 | 第167页 |
| ·淋巴细胞的分离 | 第167-168页 |
| ·淋巴细胞T细胞亚群的测定 | 第168页 |
| ·淋巴细胞细胞因子mRNA表达水平的检测 | 第168-169页 |
| ·攻毒试验 | 第169-170页 |
| ·调理吞噬试验 | 第170页 |
| 2 结果 | 第170-176页 |
| ·不同剂量ΔaroA单次免疫效果检测 | 第170页 |
| ·ΔaroA单次免疫对不同攻毒剂量的保护性评价 | 第170-171页 |
| ·血清IgG抗体水平 | 第171-172页 |
| ·脾脏淋巴细胞T细胞亚群的测定 | 第172-173页 |
| ·淋巴细胞细胞因子mRNA水平的检测 | 第173-174页 |
| ·相对免疫保护率的测定 | 第174-175页 |
| ·调理吞噬试验 | 第175-176页 |
| 3 讨论 | 第176-179页 |
| 参考文献 | 第179-184页 |
| 全文总结 | 第184-186页 |
| 博士期间发表及待发表的论文 | 第186-188页 |
| 致谢 | 第188页 |
