| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1 PRRSV分子生物学性 | 第14-17页 |
| ·PRRSV的形态学及理化特性 | 第14-15页 |
| ·PRRSV的抗原特性 | 第15页 |
| ·PRRSV的培养特性 | 第15页 |
| ·基因组结构及主要结构蛋白 | 第15-17页 |
| ·病毒基因组结构 | 第15页 |
| ·GP5蛋白 | 第15-17页 |
| ·M蛋白 | 第17页 |
| ·N蛋白 | 第17页 |
| 2 诊断技术 | 第17-20页 |
| ·病毒的分离和鉴定 | 第17-18页 |
| ·病毒抗原检测方法 | 第18-19页 |
| ·病毒中和试验 | 第18页 |
| ·间接免疫荧光抗体试验 | 第18页 |
| ·免疫过氧化物酶单层试验 | 第18页 |
| ·免疫组织化学技术 | 第18-19页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第19页 |
| ·病毒核酸检测 | 第19-20页 |
| ·反转录-聚合酶链式反应 | 第19页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第19页 |
| ·反转录-环介导等温扩增技术 | 第19-20页 |
| ·原位杂交技术 | 第20页 |
| 3 免疫学 | 第20-21页 |
| ·持续性感染 | 第20页 |
| ·免疫抑制 | 第20页 |
| ·抗体依赖性增强作用 | 第20页 |
| ·体液免疫 | 第20-21页 |
| ·细胞免疫 | 第21页 |
| 4 疫苗种类 | 第21-23页 |
| ·传统常规疫苗 | 第22页 |
| ·DNA疫苗 | 第22页 |
| ·单位疫苗 | 第22页 |
| ·活载体疫苗 | 第22-23页 |
| 5 杆状病毒表达系统 | 第23-24页 |
| ·具有良好的安全性 | 第23页 |
| ·能容纳大分子基因片段 | 第23-24页 |
| ·表达水平高 | 第24页 |
| ·表达产物具有较高的生物学活性 | 第24页 |
| 6 病毒样颗粒的特性 | 第24-25页 |
| ·VLPs的免疫学特性 | 第24-25页 |
| ·VLPs疫苗 | 第25页 |
| 7 杆状病毒作为VLPs表达载体的研究 | 第25-28页 |
| ·杆状病毒表达系统构建VLPs的原则 | 第26页 |
| ·杆状病毒表达系统构建VLPs的优势 | 第26-28页 |
| 参考文献 | 第28-36页 |
| 第二章 PRRSV截短GP5蛋白的多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立 | 第36-62页 |
| 摘要 | 第36-37页 |
| 1 材料与方法 | 第37-47页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-47页 |
| ·PRRSV截短GP5基因片段克隆引物设计和合成 | 第37-38页 |
| ·目的基因片段的扩增 | 第38页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pGEX-tGP5的构建与鉴定 | 第39-41页 |
| ·pGEX-tGP5蛋白的表达、纯化及鉴定 | 第41-44页 |
| ·pGEX-tGP5蛋白的表达 | 第41页 |
| ·重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白的Western-blot鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| ·PRRSV GP5多克隆抗体的制备 | 第44-45页 |
| ·小鼠免疫 | 第44页 |
| ·小鼠免疫后抗体效价的测定 | 第44页 |
| ·中和效价的测定 | 第44-45页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第45-46页 |
| ·抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度 | 第45页 |
| ·最佳抗原包被时间 | 第45页 |
| ·最佳封闭液 | 第45-46页 |
| ·最佳封闭时间 | 第46页 |
| ·最佳血清作用时间 | 第46页 |
| ·最佳酶标抗体作用浓度 | 第46页 |
| ·最佳底物显色时间 | 第46页 |
| ·间接ELISA检测方法临界值 | 第46页 |
| ·间接ELISA检测方法特异性 | 第46页 |
| ·间接ELISA检测方法重复性 | 第46-47页 |
| ·间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒检测结果比较 | 第47页 |
| ·间接ELISA方法筛选的临床血清中和试验 | 第47页 |
| 2 结果 | 第47-56页 |
| ·目的基因的获取 | 第47页 |
| ·重组质粒的pGEX-tGP5鉴定 | 第47-48页 |
| ·pGEX-tGP5蛋白的SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定 | 第48-49页 |
| ·pGEX-tGP5蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·多克隆抗体效价测定 | 第49-50页 |
| ·多克隆抗体血清中和试验 | 第50页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第50-54页 |
| ·最佳抗原最适包被浓度和血清稀释度 | 第50页 |
| ·最佳抗原包被时间 | 第50-51页 |
| ·最佳封闭液 | 第51页 |
| ·最佳封闭时间 | 第51-52页 |
| ·最佳血清作用时间 | 第52页 |
| ·最佳酶标抗体作用浓度 | 第52-53页 |
| ·最佳酶标抗体作用时间 | 第53页 |
| ·最佳底物作用时间 | 第53-54页 |
| ·临界值的确定 | 第54页 |
| ·特异性试验 | 第54页 |
| ·重复性试验 | 第54-55页 |
| ·批内重复性试验 | 第54页 |
| ·批间重复性试验 | 第54-55页 |
| ·tGP5蛋白间接ELISA方法与IDEXX试剂盒检测抗体水平的比较 | 第55页 |
| ·间接ELISA方法筛选的临床血清中和试验 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-60页 |
| ABSTRACT | 第60-62页 |
| 第三章 GP5糖基化位点对VLPs形成的影响 | 第62-82页 |
| 摘要 | 第62-63页 |
| 1 材料与方法 | 第63-72页 |
| ·材料 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-72页 |
| ·PRRSV GP5、M、N基因片段引物的设计与合成 | 第63页 |
| ·PRRSV GP5糖基化位点突变基因片段引物的设计与合成 | 第63-64页 |
| ·PRRSV GP5基因A/B表位之间插入HA基因的引物设计与合成 | 第64-65页 |
| ·目的基因的扩增 | 第65-66页 |
| ·穿梭质粒的构建 | 第66-69页 |
| ·重组Bacmid质粒的构建 | 第69-71页 |
| ·重组杆状病毒的获得与扩增 | 第71页 |
| ·重组蛋白在Sf9细胞中的表达与Western-blot鉴定 | 第71页 |
| ·病毒样颗粒(VLPs)的形成 | 第71-72页 |
| 2 结果 | 第72-77页 |
| ·目的基因的扩增 | 第72-73页 |
| ·穿梭质粒的鉴定 | 第73页 |
| ·重组Bacmid质粒的菌液PCR鉴定 | 第73-74页 |
| ·重组杆状病毒的获得 | 第74-75页 |
| ·重组蛋白表达后Western-blot鉴定 | 第75-76页 |
| ·电镜观察VLPs的形成 | 第76-77页 |
| 3 讨论 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| ABSTRACT | 第81-82页 |
| 第四章 杆状病毒表达的PRRSV VLPs免疫原性分析 | 第82-92页 |
| 摘要 | 第82-83页 |
| 1 材料与方法 | 第83-85页 |
| ·材料与试剂 | 第83页 |
| ·实验动物 | 第83页 |
| ·疫苗的制备 | 第83页 |
| ·小鼠免疫试验 | 第83-85页 |
| ·小鼠分组与免疫 | 第83页 |
| ·ELISA抗体检测 | 第83-84页 |
| ·中和抗体检测 | 第84-85页 |
| ·细胞因子检测 | 第85页 |
| 2 结果 | 第85-86页 |
| ·体液免疫应答 | 第85-86页 |
| ·细胞因子检测 | 第86页 |
| 3 讨论 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-90页 |
| ABSTRACT | 第90-92页 |
| 全文总结 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
