| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-20页 |
| 1 P53研究概况 | 第10-13页 |
| ·P53基因和蛋白的结构 | 第10页 |
| ·P53的生物学功能 | 第10-11页 |
| ·P53基因与肿瘤 | 第11-13页 |
| 2 P21研究概况 | 第13-15页 |
| ·P21基因和蛋白的结构 | 第13-14页 |
| ·P21的生物学功能 | 第14页 |
| ·P21基因与肿瘤 | 第14-15页 |
| 3 RNA干扰 | 第15-18页 |
| ·RNAi的重要特征 | 第15-16页 |
| ·RNAi的作用机制 | 第16页 |
| ·RNAi的表达载体 | 第16-17页 |
| ·RNAi的应用 | 第17-18页 |
| 4 本论文研究的目的和意义 | 第18页 |
| 5 前景和展望 | 第18-20页 |
| 材料和方法 | 第20-36页 |
| 1 实验材料 | 第20页 |
| 2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 3 主要仪器 | 第21页 |
| 4 实验方法 | 第21-36页 |
| ·慢病毒RNA干扰载体的构建 | 第21-26页 |
| ·选择质粒FUGW-TDT为载体 | 第21页 |
| ·将载体用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切处理 | 第21-22页 |
| ·shRNA序列设计及生物信息学分析 | 第22页 |
| ·寡核苷酸片段的溶解 | 第22页 |
| ·DNA oligo的退火及PNK处理 | 第22-23页 |
| ·连接反应 | 第23页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第23-24页 |
| ·菌液PCR及阳性克隆测序鉴定 | 第24页 |
| ·质粒提取 | 第24-25页 |
| ·COS-7细胞的复苏 | 第25页 |
| ·COS-7细胞的传代 | 第25页 |
| ·COS-7细胞的冻存 | 第25-26页 |
| ·慢病毒过表达载体瞬时转染COS-7细胞 | 第26页 |
| ·用荧光激活细胞分选仪(FACS)分选红色荧光细胞 | 第26页 |
| ·RNA提取、逆转录及SYBR-Green法RT-PCR | 第26-28页 |
| ·RNA提取 | 第26-27页 |
| ·逆转录 | 第27页 |
| ·Real-time PCR | 第27-28页 |
| ·Western Blot | 第28-29页 |
| ·病毒颗粒包装及滴度测定 | 第29-32页 |
| ·293T细胞的复苏 | 第29页 |
| ·293T细胞的传代 | 第29页 |
| ·293T细胞的冻存 | 第29-30页 |
| ·转染前质粒的大量制备与纯化 | 第30页 |
| ·慢病毒的包装 | 第30页 |
| ·慢病毒的浓缩与纯化 | 第30-31页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第31-32页 |
| ·慢病毒的储存与稀释 | 第32页 |
| ·恒河猴胚胎构建及病毒感染 | 第32-36页 |
| ·超数排卵 | 第32-33页 |
| ·卵母细胞采集 | 第33页 |
| ·精子采集 | 第33-34页 |
| ·单精子卵胞质内注射(ICSI) | 第34页 |
| ·卵周隙注射慢病毒 | 第34-35页 |
| ·体外培养 | 第35页 |
| ·胚胎的转基因确认 | 第35-36页 |
| 实验结果 | 第36-46页 |
| 5 shRNA靶点设计及载体构建 | 第36-38页 |
| ·生物信息学分析 | 第36页 |
| ·P53和P21慢病毒沉默载体构建 | 第36-37页 |
| ·慢病毒表达载体FUGW-TDT的Xho Ⅰ和Xba Ⅰ 双酶切结果 | 第37页 |
| ·菌液PCR鉴定阳性克隆 | 第37-38页 |
| 6 shRNA靶点细胞水平的筛选验证 | 第38-42页 |
| ·P53和P21在COS-7细胞中含量检测 | 第38-39页 |
| ·P53和P21mRNA水平沉默效率检测 | 第39-40页 |
| ·P53和P21蛋白水平沉默效率检测 | 第40-42页 |
| 7 慢病毒包装及胚胎水平感染 | 第42-46页 |
| ·慢病毒载体的包装 | 第42页 |
| ·病毒滴度测定 | 第42-43页 |
| ·猕猴超排后各期卵母细胞及胚胎 | 第43-44页 |
| ·猕猴胚胎体外培养成熟发育情况 | 第44-45页 |
| ·恒河猴受精卵卵周隙注射慢病毒及胚胎荧光检测 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46-50页 |
| 小结 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-56页 |
| 附录 | 第56-57页 |
| 缩略词 | 第57-59页 |
| 个人简介 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
