| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-22页 |
| ·RNA 沉默 | 第12-13页 |
| ·miRNA 的产生与作用机制 | 第13-16页 |
| ·miRNA 的发现 | 第13-14页 |
| ·miRNA 的特点 | 第14页 |
| ·miRNA 的产生与作用过程 | 第14-16页 |
| ·miRNA 的功能 | 第16页 |
| ·人工 miRNA（amiRNA）策略 | 第16-21页 |
| ·amiRNA 策略的发展与应用 | 第17-18页 |
| ·amiRNA 的特点 | 第18页 |
| ·人工 miRNA 技术的影响因素 | 第18-20页 |
| ·amiRNA 介导的植物抗病毒策略 | 第20-21页 |
| ·本研究的目的与意义 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-49页 |
| ·材料 | 第22-23页 |
| ·毒源 | 第22页 |
| ·供试植物 | 第22页 |
| ·菌株、质粒、pre-miRNA | 第22页 |
| ·酶与各种生化试剂 | 第22-23页 |
| ·方法 | 第23-49页 |
| ·amiRNA 植物重组表达载体构建 | 第23-27页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·转化菌落 PCR 鉴定 | 第28页 |
| ·质粒 DNA 的大量提取（碱性 SDS 法） | 第28-30页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组表达载体向农杆菌中的转化（冻融法） | 第31页 |
| ·转化农杆菌后菌落 PCR 鉴定 | 第31页 |
| ·农杆菌转化的质粒提取与酶切鉴定 | 第31页 |
| ·农杆菌介导的瞬时表达 | 第31-32页 |
| ·农杆菌介导的烟草转化及转基因烟草获得 | 第32页 |
| ·小量法提取转基因烟草总 DNA | 第32-33页 |
| ·转基因烟草植株的 PCR 鉴定 | 第33页 |
| ·T1代转基因植株的抗病性鉴定及酶联免疫吸附检测（ELISA） | 第33-34页 |
| ·T1代转基因烟草植株抗病性鉴定 | 第33-34页 |
| ·转基因植株的 ELISA 检测 | 第34页 |
| ·Northern 杂交分析 | 第34-39页 |
| ·转基因植株总 RNA 的提取（Trizol 一步提取法） | 第34-35页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳 | 第35页 |
| ·转膜 | 第35-36页 |
| ·探针制备 | 第36-37页 |
| ·DIG 标记有效性检测 | 第37-38页 |
| ·杂交 | 第38-39页 |
| ·转基因植株 miRNA 的提取及杂交分析 | 第39-42页 |
| ·转基因植株 miRNA 的提取 | 第39-40页 |
| ·miRNA 电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳） | 第40-41页 |
| ·miRNA 转膜（电转膜）及固定 | 第41-42页 |
| ·miRNA 探针的制备 | 第42页 |
| ·miRNA 杂交 | 第42页 |
| ·转基因植株的 Southern 杂交分析 | 第42-46页 |
| ·植物总 DNA 的提取（CTAB 法） | 第42页 |
| ·植物总 DNA 的酶切 | 第42-43页 |
| ·总 DNA 凝胶电泳 | 第43页 |
| ·转膜 | 第43-44页 |
| ·探针标记（随机引物法） | 第44页 |
| ·DIG 标记有效性检测 | 第44-45页 |
| ·杂交 | 第45-46页 |
| ·转基因植株中 miRNA 靶基因剪切位点的验证 | 第46页 |
| ·5′RLM-RACE | 第46-48页 |
| ·T2代遗传稳定性分析 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-67页 |
| ·靶序列的选择 | 第49-50页 |
| ·pre-miRNA319a 中目的序列替换 | 第50页 |
| ·植物表达载体的构建与鉴定 | 第50-52页 |
| ·植物表达载体的 PCR 鉴定 | 第50-51页 |
| ·植物表达载体的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·植物重组表达载体向农杆菌中转化 | 第52-53页 |
| ·amiRNAs 的瞬时表达检测 | 第53页 |
| ·转基因烟草的获得 | 第53-54页 |
| ·转基因烟草 PCR 检测 | 第54-55页 |
| ·转基因烟草抗病性分析 | 第55-61页 |
| ·转基因烟草对 PVYN株系的抗性分析 | 第56-57页 |
| ·转基因烟草对 TEV-SD1 株系的抗性分析 | 第57-59页 |
| ·转基因植株对 PVYN与 TEV-SD1 的抗性分析 | 第59-61页 |
| ·转基因烟草的 Northern 杂交 | 第61-63页 |
| ·转基因烟草的 Northern 杂交 | 第61-62页 |
| ·转基因烟草的 amiRNA 杂交 | 第62-63页 |
| ·转基因烟草的 Southern 杂交 | 第63-64页 |
| ·pre-amiRs 植株靶基因剪切位点验证 | 第64-65页 |
| ·T2代转基因烟草抗性遗传稳定性分析 | 第65-67页 |
| 4 讨论 | 第67-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 硕士阶段发表论文情况 | 第81页 |
