| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 缩写表 | 第11-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-36页 |
| ·Mip蛋白研究概述 | 第16-20页 |
| ·Mip蛋白的定义、分布及功能 | 第16-18页 |
| ·Mip蛋白是FKBP类型PPIase | 第18-20页 |
| ·Mip蛋白研究进展 | 第20-28页 |
| ·Mip蛋白的亚细胞定位 | 第20-22页 |
| ·Mip蛋白的结构特点 | 第22-26页 |
| ·Mip蛋白参与致病的机制及天然靶标的鉴定 | 第26-28页 |
| ·十字花科黑腐病菌Mip_(Xcc)蛋白研究进展 | 第28-35页 |
| ·十字花科黑腐病菌致病因子 | 第28-31页 |
| ·十字花科黑腐病菌致病调控系统 | 第31-34页 |
| ·十字花科黑腐病菌Mip_(Xcc)蛋白研究 | 第34-35页 |
| ·本研究目的与意义 | 第35-36页 |
| 第二章 材料和方法 | 第36-62页 |
| ·实验材料 | 第36-44页 |
| ·实验所用菌株 | 第36-37页 |
| ·菌株培养及保存 | 第37-38页 |
| ·质粒 | 第38-39页 |
| ·引物 | 第39-40页 |
| ·抗生素 | 第40页 |
| ·培养基 | 第40-41页 |
| ·常用溶液、缓冲液 | 第41-44页 |
| ·细菌操作实验方法 | 第44-47页 |
| ·细菌基因组DNA提取 | 第44-45页 |
| ·质粒DNA提取 | 第45页 |
| ·细菌总RNA提取 | 第45-46页 |
| ·电脉冲感受态细胞的制备 | 第46页 |
| ·电脉冲转化 | 第46-47页 |
| ·三亲接合 | 第47页 |
| ·分子克隆实验方法 | 第47-51页 |
| ·常规PCR | 第47-48页 |
| ·融合PCR | 第48-49页 |
| ·反转录RT-PCR | 第49页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第49-50页 |
| ·DNA片段纯化 | 第50页 |
| ·DNA酶切和连接 | 第50-51页 |
| ·细菌双杂交实验方法 | 第51-54页 |
| ·双杂交系统原理 | 第51-52页 |
| ·诱饵质粒的构建和确认 | 第52-53页 |
| ·靶标和DNA表达文库的构建 | 第53-54页 |
| ·阳性相互作用的确认 | 第54页 |
| ·蛋白操作实验方法 | 第54-62页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第54-55页 |
| ·考马斯亮蓝染色 | 第55-56页 |
| ·蛋白质定量 | 第56页 |
| ·6xHis标签和HAT标签蛋白表达纯化 | 第56-57页 |
| ·黄单胞菌胞外、周质、外膜和总蛋白提取 | 第57-58页 |
| ·Western Blot蛋白印迹 | 第58-59页 |
| ·Far-Western Assay | 第59页 |
| ·蛋白酶活性检测 | 第59-60页 |
| ·细菌周质蛋白原位释放 | 第60页 |
| ·蛋白酶复性实验 | 第60-62页 |
| 第三章 mip_(Xcc)基因突变不影响胞外蛋白酶基因的转录和Ⅱ型分泌系统的功能 | 第62-68页 |
| ·引言 | 第62页 |
| ·mip_(Xcc)突变不影响主胞外蛋白酶基因prtA的转录 | 第62-64页 |
| ·prtA是Xcc 8004的主胞外蛋白酶编码基因 | 第63页 |
| ·半定量RT-PCR检测prtA的转录 | 第63-64页 |
| ·组成型表达PrtA不能恢复NK2699的胞外蛋白酶活性 | 第64-65页 |
| ·mip_(Xcc)突变不影响Ⅱ型分泌系统的功能 | 第65-66页 |
| ·小结 | 第66-68页 |
| 第四章 Mip_(Xcc)蛋白定位在细胞的周质空间 | 第68-73页 |
| ·引言 | 第68页 |
| ·生物信息学预测Mip_(Xcc)蛋白的亚细胞定位 | 第68-70页 |
| ·Western Blot证实Mip_(Xcc)是周质蛋白 | 第70-72页 |
| ·构建NK2699／pR3MipH6菌株 | 第70-71页 |
| ·Western Blotting验证Mip_(Xcc)蛋白的亚细胞定位 | 第71-72页 |
| ·小结 | 第72-73页 |
| 第五章 胞外蛋白酶PrtA是Mip_(Xcc)蛋白的作用靶标 | 第73-93页 |
| ·引言 | 第73页 |
| ·细菌双杂交分析Mip_(Xcc)与胞外蛋白酶的相互作用 | 第73-77页 |
| ·构建细菌双杂交系统融合表达质粒 | 第73-75页 |
| ·细菌双杂交显示Mip_(Xcc)蛋白与4个胞外蛋白酶有相互作用 | 第75-77页 |
| ·Far-Western和免疫共沉淀证实Mip_(Xcc)与PrtA互作 | 第77-83页 |
| ·构建表达(His)_6-Mip_(Xcc)蛋白的pQEMip质粒 | 第77-79页 |
| ·构建表达HAT-PrtA融合蛋白的pHATPrtA质粒 | 第79-80页 |
| ·表达纯化(His)_6-Mip_(Xcc),HAT-PrtA,HAT-DHFR蛋白 | 第80-81页 |
| ·Far Western blotting assay | 第81-82页 |
| ·免疫共沉淀证实Mip_(Xcc)与PrtA在Xcc胞内互作 | 第82-83页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白拯救NK2699周质蛋白的蛋白酶活性 | 第83-84页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白的PPIase结构域是与PrtA相互作用所必需 | 第84-88页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白的结构域分析 | 第84-85页 |
| ·Mip_(Xcc)不同结构域融合表达质粒的构建 | 第85-86页 |
| ·细菌双杂交显示Mip_(Xcc)蛋白的PPIase结构域与PrtA互作 | 第86-88页 |
| ·PPIase结构域的五个保守氨基酸是与PrtA相互作用所必需 | 第88-91页 |
| ·构建五个保守氨基酸点突变的融合表达质粒 | 第88-90页 |
| ·点突变的Mip_(Xcc)蛋白与PrtA没有相互作用 | 第90-91页 |
| ·小结 | 第91-93页 |
| 第六章 Mip_(Xcc)蛋白其他互作靶标的筛选 | 第93-100页 |
| ·引言 | 第93-94页 |
| ·Mip_(Xcc)诱饵蛋白的自激活检测 | 第94-95页 |
| ·基因组DNA表达文库的构建和检测 | 第95-96页 |
| ·细菌双杂交筛选Mip_(Xcc)蛋白的作用靶标 | 第96-98页 |
| ·小结 | 第98-100页 |
| 第七章 讨论 | 第100-109页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白与胞外蛋白酶的成熟有关 | 第100-101页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白的作用靶标和互作机理 | 第101-105页 |
| ·Mip_(Xcc)蛋白参与致病的机制 | 第105-109页 |
| 参考文献 | 第109-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 攻读博士学位期间完成的研究论文 | 第123页 |
