| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 前言 | 第11-13页 |
| 技术路线 | 第13-14页 |
| 第一部分 ZO-1 PDZ1结构域的结合特性 | 第14-24页 |
| 前言 | 第14-15页 |
| 实验结果 | 第15-24页 |
| 一、含有诱饵蛋白的CG1945菌株HIS表达背景的检测 | 第15页 |
| 二、用随机多肽文库研究ZO1 PDZ1结构域结合配体特性 | 第15-18页 |
| 1.酵母双杂交实验结果 | 第15-18页 |
| 2.酵母双杂交实验结果分析 | 第18页 |
| 三、与其它PDZ结构域的配体相互作用结果 | 第18页 |
| 四、结合配体C—末端数据库检索 | 第18-23页 |
| 五、验证ZO-1 PDZ1结构域与预测的天然蛋白质之间的相互作用 | 第23-24页 |
| 第二部分 VELI3 PDZ结构域的结合特性 | 第24-33页 |
| 前言 | 第24-26页 |
| 实验结果 | 第26-33页 |
| 一、含有诱饵蛋白的CG1945菌株HIS表达背景的检测 | 第26页 |
| 二、用随机多肽文库研究目的结构域结合配体特性 | 第26-29页 |
| 1.酵母双杂交实验结果 | 第26-29页 |
| 2.酵母双杂交实验结果分析 | 第29页 |
| 三、结合配体C—末端数据库检索 | 第29-33页 |
| 第三部分 PAR3L PDZ1结构域的结合特性 | 第33-39页 |
| 前言 | 第33-34页 |
| 实验结果 | 第34-39页 |
| 一、含有诱饵蛋白的CG1945菌株HIS表达背景的检测 | 第34页 |
| 二、用随机多肽文库研究目的结构域结合配体特性 | 第34-36页 |
| 1.酵母双杂交实验结果 | 第34-36页 |
| 2.酵母双杂交实验结果分析 | 第36页 |
| 三、结合配体C—末端数据库检索 | 第36-39页 |
| 讨论 | 第39-45页 |
| 一、目的PDZ结构域配体的结合特性分析 | 第39-40页 |
| 二、配体库的组成和作用 | 第40-41页 |
| 三、目的结构域潜在的结合配体 | 第41-44页 |
| 1.ZO-1 PDZ1结构域的潜在结合配体 | 第41-42页 |
| 2.Veli3 PDZ结构域潜在结合配体 | 第42-43页 |
| 3.PAR3L PDZ1结构域潜在结合配体 | 第43-44页 |
| 四、目的PDZ结构域优化配体可作为潜在的多肽药物设计序列 | 第44页 |
| 五、酵母双杂交实验假阳性分析 | 第44-45页 |
| 小结 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 材料与方法 | 第50-76页 |
| 一、实验材料 | 第50-57页 |
| 二、实验方法 | 第57-71页 |
| (一) 基本生物化学实验方法 | 第57-59页 |
| 1.载体质粒的小量制备(试剂盒法) | 第57页 |
| 2.载体质粒的大量制备(试剂盒法) | 第57-58页 |
| 3.化学感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| 4.电感受态细胞的制备 | 第59页 |
| (二) 酵母双杂交方法"诱饵质粒"的构建 | 第59-62页 |
| 1.聚合酶链式反应(PCR)克隆目的结构域基因 | 第59-60页 |
| 2.PCR产物的回收和纯化 | 第60页 |
| 3.限制性内切酶双酶切目的DNA片段与载体 | 第60-61页 |
| 4.连接反应 | 第61页 |
| 5.连接产物的感受态大肠杆菌的转化 | 第61页 |
| 6.PCR方法鉴定目的结构域的插入 | 第61-62页 |
| 7.初步鉴定有目的插入片段的菌种的保存 | 第62页 |
| (三) 目的结构域酵母双杂交方法筛选随机多肽文库 | 第62-68页 |
| 1.酵母菌株的保存与表型验证 | 第62页 |
| 2.含有目的结构域基因的BD载体小量快速转化到CG1945酵母细胞中 | 第62-63页 |
| 3.诱饵蛋白自激活检测 | 第63页 |
| 4.含有诱饵蛋白的CG1945菌株HIS表达背景的检测 | 第63页 |
| 5.将随机多肽文库转化含目的结构域基因的酵母细胞CG1945中 | 第63-66页 |
| 6.去除假阳性结果 | 第66-68页 |
| (四) 筛选结果的生物信息学分析 | 第68-69页 |
| 1.测序结果的序列分析 | 第68-69页 |
| 2.C-末端序列的数据库检索 | 第69页 |
| (五) 验证目的PDZ结构域与预测的天然蛋白质之间的相互作用 | 第69-71页 |
| 三、本研究含目的基因载体的构建 | 第71-76页 |
| 1.含Veli3 PDZ结构域载体的构建 | 第71-73页 |
| 2.含PAR3L PDZ1结构域载体的构建 | 第73-76页 |
| 综述 | 第76-86页 |
| 参考文献 | 第84-86页 |
| 附录Ⅰ ZO-1 PDZ1结构域相互作用配体测序结果 | 第86-102页 |
| 附录Ⅱ VELI3 PDZ结构域相互作用配体测序结果 | 第102-110页 |
| 附录Ⅲ PAR3L PDZ1结构域相互作用配体测序结果 | 第110-120页 |
| 附录Ⅳ 英文缩写词表 | 第120-121页 |
| 附录Ⅴ 硕士期间发表论文 | 第121-122页 |
| 致谢 | 第122页 |
