| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-33页 |
| 引言 | 第16-17页 |
| 1 斑点叉尾鮰病毒性疾病 | 第17-23页 |
| ·流行病学特征 | 第17-18页 |
| ·病理特征 | 第18-20页 |
| ·血清学 | 第20页 |
| ·潜伏期 | 第20-21页 |
| ·斑点叉尾鮰疱疹病毒病的防控技术 | 第21-23页 |
| 2 斑点叉尾鮰病毒 | 第23-28页 |
| ·分类地位 | 第23-24页 |
| ·理化性质 | 第24页 |
| ·斑点叉尾鮰病毒的生长、繁殖 | 第24页 |
| ·分子生物学特性 | 第24-27页 |
| ·基因组 | 第24-25页 |
| ·斑点叉尾鮰病毒编码蛋白质 | 第25-27页 |
| ·糖蛋白在病毒个体相互作用中的重要性 | 第27-28页 |
| 3 斑点叉尾鮰病毒病的诊断和检测技术 | 第28-31页 |
| ·PCR-ELISA技术及应用 | 第29-31页 |
| 4 研究目的与意义 | 第31-32页 |
| ·斑点叉尾鮰疱疹病毒囊膜蛋白特性和定位研究的目的与意义 | 第31页 |
| ·斑点叉尾鮰疱疹病毒检测方法研究的目的与意义 | 第31-32页 |
| 5 本研究的总体设计和技术路线 | 第32-33页 |
| 第二章 斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF10基因的克隆与原核表达 | 第33-52页 |
| 1 材料与方法 | 第33-43页 |
| ·实验材料 | 第33-36页 |
| ·本实验使用的生物材料和原核表达载体 | 第33-34页 |
| ·细胞培养使用的主要试剂 | 第34-35页 |
| ·原核表达载体使用的主要试剂 | 第35页 |
| ·蛋白表达和纯化使用的主要试剂 | 第35页 |
| ·DNA和蛋白质分子量标准 | 第35-36页 |
| ·实验所用仪器设备及产地 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-43页 |
| ·细胞培养、病毒增殖和病毒DNA提取 | 第36-37页 |
| ·细胞培养 | 第36-37页 |
| ·病毒增殖 | 第37页 |
| ·病毒DNA提取 | 第37页 |
| ·病毒基因组DNA的PCR扩增和检测 | 第37-39页 |
| ·特异性引物的设计 | 第37页 |
| ·PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·PCR扩增产物的检测 | 第38-39页 |
| ·构建原核表达载体 | 第39-41页 |
| ·PCR扩增产物的纯化 | 第39页 |
| ·目的片段的连接 | 第39页 |
| ·目的片段的转化 | 第39-40页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第40-41页 |
| ·诱导表达 | 第41-42页 |
| ·E.coli AD494(DE3)感受态的制备 | 第41页 |
| ·阳性重组子的转化 | 第41页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第42页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第42页 |
| ·收集包涵体 | 第42页 |
| ·亲和层析法纯化蛋白 | 第42页 |
| ·表达蛋白的Western Blot检测 | 第42-43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-50页 |
| ·CCO细胞的培养 | 第43页 |
| ·CCV的增殖 | 第43-45页 |
| ·ORF10的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测 | 第45页 |
| ·重组表达载体的酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·重组表达载体的测序鉴定 | 第46页 |
| ·ORF10在大肠杆菌中的诱导表达 | 第46-50页 |
| ·不同时间诱导表达结果 | 第46-48页 |
| ·Western Blot分析 | 第48页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第48-50页 |
| 3 讨论 | 第50-52页 |
| 第三章 斑点叉尾鮰疱疹病毒orf10基因鉴定及定位研究 | 第52-64页 |
| 1 材料和方法 | 第52-56页 |
| ·实验材料 | 第52-53页 |
| ·细胞、病毒和免疫兔 | 第52-53页 |
| ·试剂和耗材 | 第53页 |
| ·仪器和设备 | 第53页 |
| ·实验方法 | 第53-56页 |
| ·CCV病毒分离纯化 | 第53页 |
| ·透射电子显微镜(TEM)负染观察病毒 | 第53-54页 |
| ·病毒囊膜和核衣壳的分离与制备 | 第54页 |
| ·多克隆抗体的制备和检测 | 第54-55页 |
| ·抗血清的制备 | 第54页 |
| ·抗血清的Western Blot分析 | 第54-55页 |
| ·蛋白免疫印迹 | 第55页 |
| ·免疫电子显微 | 第55-56页 |
| ·中和保护试验 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-62页 |
| ·CCV病毒粒子的电子显微镜负染图片 | 第56页 |
| ·抗血清的特异性检测 | 第56-57页 |
| ·蛋白免疫印迹和orf10功能特性 | 第57-59页 |
| ·免疫电子显微和orf10囊膜蛋白在病毒粒子中的物理定位 | 第59页 |
| ·体外中和试验和orf10功能特性 | 第59-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 第四章 斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析 | 第64-70页 |
| 1 材料与方法 | 第64-66页 |
| ·菌株与载体 | 第64-65页 |
| ·酶类及主要生化试剂 | 第65页 |
| ·目的基因的重组表达载体pGEX-4T-2-ORF6的构建 | 第65页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的可溶表达 | 第65-66页 |
| ·融合蛋白GST-GP6的纯化 | 第66页 |
| ·Western-Blot免疫印迹 | 第66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-69页 |
| ·原核重组表达质粒pGEX-4T-2-GP6的酶切鉴定序列测序 | 第66-67页 |
| ·原核重组表达质粒pGEX-4T-2-ORF6的蛋白表达鉴定 | 第67-68页 |
| ·重组蛋白GST-GP6的分离纯化 | 第68页 |
| ·重组蛋白的免疫原性鉴定 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-70页 |
| 第五章 斑点义尾鮰病毒PCR—ELISA检测方法的建立 | 第70-93页 |
| 1 材料与方法 | 第70-78页 |
| ·实验材料 | 第70-73页 |
| ·实验用鱼 | 第70页 |
| ·细胞系、病毒和菌株 | 第70-71页 |
| ·主要仪器设备及产地 | 第71页 |
| ·主要试剂及药品 | 第71-72页 |
| ·主要培养基 | 第72页 |
| ·引物和探针 | 第72-73页 |
| ·实验方法 | 第73-78页 |
| ·斑点叉尾鮰病料的制备 | 第73页 |
| ·细胞的培养和病毒的增殖 | 第73页 |
| ·病毒DNA提取 | 第73-74页 |
| ·生物素标记的PCR扩增和检测 | 第74-75页 |
| ·ELISA最佳反应条件的确定 | 第75-76页 |
| ·包被条件优化 | 第75页 |
| ·杂交条件优化 | 第75-76页 |
| ·显色条件优化 | 第76页 |
| ·Cutoff值的确定 | 第76页 |
| ·特异性检验 | 第76-77页 |
| ·敏感性检验 | 第77页 |
| ·扩增模板量回归分析 | 第77页 |
| ·重复性试验 | 第77-78页 |
| ·样品检测 | 第78页 |
| ·数据处理 | 第78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-89页 |
| ·斑点叉尾鮰病毒orf6基因PCR扩增产物电泳检测结果 | 第78-79页 |
| ·序列测定 | 第79页 |
| ·斑点叉尾鮰病毒PCR-ELISA检测方法的建立 | 第79-84页 |
| ·包被条件优化结果 | 第79-81页 |
| ·杂交条件优化结果 | 第81-82页 |
| ·地高辛探针最佳浓度的确定 | 第81页 |
| ·最佳杂交退火温度的确定 | 第81-82页 |
| ·最佳杂交退火时间的确定 | 第82页 |
| ·显色条件优化结果 | 第82-83页 |
| ·杂交和ELISA步骤 | 第83-84页 |
| ·cutoff值的确定 | 第84页 |
| ·特异性实验 | 第84-85页 |
| ·灵敏度实验 | 第85-86页 |
| ·模板DNA量与D405nm值的相关性 | 第86-87页 |
| ·重复性试验 | 第87页 |
| ·样品检测结果 | 第87-89页 |
| 3 讨论 | 第89-91页 |
| ·PCR-ELISA检测技术的优越性 | 第89页 |
| ·PCR产物的包被 | 第89-90页 |
| ·杂交程序的选择 | 第90页 |
| ·杂交条件的优化 | 第90-91页 |
| ·方法特异性 | 第91页 |
| ·方法敏感性 | 第91页 |
| 4 小结 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-104页 |
| 附录Ⅰ：主要试剂配制方法 | 第104-110页 |
| 附录Ⅱ：研究生在读期间发表的论文 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
