| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-21页 |
| ·肌酐的测定方法 | 第9-12页 |
| ·化学检测方法 | 第9页 |
| ·酶促检测方法 | 第9-12页 |
| ·以肌酐亚氨基水解酶偶联谷氨酸脱氢酶法 | 第10页 |
| ·肌酐水解酶偶联肌酸激酶法 | 第10-11页 |
| ·肌酐水解酶偶联肌氨酸氧化酶法 | 第11-12页 |
| ·肌酸水解酶的研究现状 | 第12-17页 |
| ·肌酸水解酶的发现 | 第12页 |
| ·微生物中肌酸水解酶的研究 | 第12-14页 |
| ·肌酸水解酶的性质 | 第14-15页 |
| ·肌酸水解酶的分子生物学研究现状 | 第15-17页 |
| ·同源序列法和反向PCR在基因克隆的应用 | 第17-19页 |
| ·同源序列法 | 第17页 |
| ·反向PCR | 第17-19页 |
| ·本研究的目的和研究策略 | 第19-21页 |
| ·研究目的 | 第19-20页 |
| ·研究策略 | 第20-21页 |
| 第二章 芽孢杆菌 Bacillus sp. BSD-8肌酸水解酶基因的克隆、测序与表达 | 第21-37页 |
| ·材料 | 第21-23页 |
| ·菌种和载体 | 第21页 |
| ·引物 | 第21页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第21-22页 |
| ·其它试剂 | 第22页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第22-23页 |
| ·常用仪器 | 第23页 |
| ·实验方法 | 第23-30页 |
| ·Bacillus sp. BSD-8基因组 DNA的提取 | 第23页 |
| ·Bacillus sp. BSD-8肌酸水解酶基因的克隆和测序 | 第23-25页 |
| ·基因克隆策略 | 第23-24页 |
| ·PCR扩增基因序列 | 第24页 |
| ·PCR扩增基因侧翼序列 | 第24-25页 |
| ·PCR产物测序及序列分析 | 第25页 |
| ·扩增肌酸水解酶基因全序列 | 第25页 |
| ·构建重组质粒 | 第25-27页 |
| ·质粒 PET-28a(+)的提取 | 第25-26页 |
| ·PCR产物及质粒的酶切 | 第26页 |
| ·酶切产物电泳并割胶回收 | 第26页 |
| ·外源 DNA与质粒的连接反应 | 第26-27页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第27-28页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·重组质粒的转化 | 第27-28页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第28页 |
| ·菌落 PCR | 第28页 |
| ·重组质粒双酶切及测序 | 第28页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第29-30页 |
| ·结果与分析 | 第30-36页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8 CRE基因的扩增 | 第30-34页 |
| ·重组载体pET-28a-CRE的构建 | 第34-35页 |
| ·重组载体pET-28a-CRE的表达 | 第35-36页 |
| ·讨论 | 第36-37页 |
| 第三章 重组肌酸水解酶的纯化及其性质研究 | 第37-48页 |
| ·材料 | 第37-38页 |
| ·材料及试剂 | 第37页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第37页 |
| ·主要仪器 | 第37-38页 |
| ·方法 | 第38-40页 |
| ·菌体的大量培养 | 第38页 |
| ·重组酶的纯化 | 第38-39页 |
| ·粗酶液的制备 | 第38-39页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第39页 |
| ·Ni-IDA His-Band亲和柱的清洗、离子化和平衡 | 第39页 |
| ·Ni-IDA His-Band亲和柱分离重组酶 | 第39页 |
| ·重组肌酸水解酶性质的研究 | 第39-40页 |
| ·酶分子量的测定 | 第39页 |
| ·酶的最佳反应 pH及 pH稳定性 | 第39-40页 |
| ·酶的最佳反应温度及热稳定性 | 第40页 |
| ·不同化学物质对酶活力的影响 | 第40页 |
| ·酶促反应动力学研究 | 第40页 |
| ·结果与分析 | 第40-45页 |
| ·肌酸水解酶的纯化结果 | 第40-41页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第40-41页 |
| ·Ni-IDA His-Band亲和柱纯化结果 | 第41页 |
| ·重组酶的最适反应 pH及 pH稳定性 | 第41-42页 |
| ·酶的最适反应温度与热稳定性 | 第42-43页 |
| ·各种金属离子及化学试剂对酶活的影响 | 第43-44页 |
| ·酶促反应动力学研究 | 第44-45页 |
| ·讨论 | 第45-48页 |
| 第四章 结论与展望 | 第48-50页 |
| ·结论 | 第48-49页 |
| ·后续研究展望 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-52页 |
