| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 引言 | 第12页 |
| 1.2 RNA解旋酶 | 第12-17页 |
| 1.3 DEAD-box RNA解旋酶 | 第17-19页 |
| 1.4 大肠杆菌中DEAD-box RNA解旋酶CsdA | 第19-22页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第22-60页 |
| 2.1 基因克隆 | 第22-29页 |
| 2.1.1 CsdA全长边界的选择及引物设计 | 第22-23页 |
| 2.1.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定及分离纯化PCR扩增的目标DNA片段 | 第23-24页 |
| 2.1.3 回收凝胶分离的目标DNA片段 | 第24页 |
| 2.1.4 质粒抽提 | 第24-25页 |
| 2.1.5 双酶切 | 第25页 |
| 2.1.6 连接 | 第25-26页 |
| 2.1.7 转化 | 第26-27页 |
| 2.1.8 保菌送测序 | 第27页 |
| 2.1.9 目的蛋白质的表达 | 第27页 |
| 2.1.10 目的蛋白质的纯化 | 第27-28页 |
| 2.1.11 酶切目的蛋白质上的His-tag标签 | 第28页 |
| 2.1.12 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第28页 |
| 2.1.13 凝胶过滤层析 | 第28-29页 |
| 2.2 CsdA_5-211晶体的筛选 | 第29页 |
| 2.3 核磁结构的解析 | 第29-33页 |
| 2.3.1 CsdA_RBD核磁样品的准备 | 第29-30页 |
| 2.3.2 NMR实验 | 第30-32页 |
| 2.3.3 核磁结构计算 | 第32-33页 |
| 2.4 ~(19)F-PRE实验 | 第33-37页 |
| 2.4.1 ~(19)F标记的基本原理 | 第33-34页 |
| 2.4.2 ~(19)F标记菌种的构建 | 第34-35页 |
| 2.4.3 ~(19)F标记样品的表达 | 第35页 |
| 2.4.4 ~(19)F标记蛋白质的纯化 | 第35-36页 |
| 2.4.5 圆二色光谱(CD)法检测突变蛋白质二级结构 | 第36页 |
| 2.4.6 ~(19)F标记蛋白质中引入顺磁标签MTSL | 第36-37页 |
| 2.4.7 一维~(19)F核磁数据的记录及处理 | 第37页 |
| 2.5 X-射线小角散射实验(Small angle X-ray scattering,SAXS) | 第37-38页 |
| 2.6 动态光散射实验(Dynamic Light Scattering,DLS) | 第38页 |
| 2.7 CsdA_445以及CsdA_564结构模型的搭建 | 第38页 |
| 2.8 RNA的体外转录 | 第38-49页 |
| 2.8.1 RNA的转录模板 | 第38-45页 |
| 2.8.2 RNA的转录体系以及T7 RNA聚合酶的纯化 | 第45-46页 |
| 2.8.3 转录产物的预处理及纯化 | 第46-49页 |
| 2.9 ATPase活性实验 | 第49-51页 |
| 2.9.1 ATPase活性实验的测定原理 | 第49-50页 |
| 2.9.2 ATPase活性实验的测定 | 第50-51页 |
| 2.10 解旋酶活性实验 | 第51-52页 |
| 2.11 荧光偏振实验(Fluorescence Polarization,FP) | 第52-54页 |
| 2.12 基因敲除及Western blotting检测 | 第54-60页 |
| 2.12.1 基因敲除实验 | 第54-57页 |
| 2.12.2 Western blotting检测实验 | 第57-60页 |
| 第三章 CsdA结构与功能的研究 | 第60-96页 |
| 3.1 引言 | 第60-62页 |
| 3.2 实验结果 | 第62-91页 |
| 3.2.1 CsdA的结构 | 第62-75页 |
| 3.2.2 SAXS与19F-PRE实验研究CsdA在溶液中的结构 | 第75-81页 |
| 3.2.3 利用SAXS及~(19)F-PRE数据搭建CsdA在溶液中的结构模型 | 第81-83页 |
| 3.2.4 CsdA的二聚体结构域的特点及功能 | 第83-86页 |
| 3.2.5 C-端延伸区对于CsdA的酶活性影响 | 第86-88页 |
| 3.2.6 C-端延伸区对CsdA的RNA结合能力的影响 | 第88-91页 |
| 3.3 讨论 | 第91-96页 |
| 3.3.1 CsdA以二聚体形式稳定存在于低温环境中 | 第91-92页 |
| 3.3.2 CsdA的C-端区域参与RNA的结合 | 第92-93页 |
| 3.3.3 SAXS以及~(19)F-PRE相结合研究多结构域蛋白质 | 第93-96页 |
| 参考文献 | 第96-106页 |
| 附录 | 第106-126页 |
| 致谢 | 第126-128页 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 | 第128页 |
