| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-14页 |
| 1 引言 | 第14-39页 |
| ·猪瘟的病原学研究 | 第14-17页 |
| ·CSFV 病毒粒子的形态结构及理化特征 | 第14-15页 |
| ·CSFV 的抗原性、毒力和分型 | 第15-16页 |
| ·CSFV 的致病机理 | 第16页 |
| ·CSFV 的侵入与复制 | 第16-17页 |
| ·猪瘟的流行病学 | 第17-18页 |
| ·CSFV 的传播方式 | 第17页 |
| ·CSF 的流行情况 | 第17-18页 |
| ·CSF 的病理变化 | 第18页 |
| ·CSFV 主要基因与功能的研究 | 第18-24页 |
| ·猪瘟病毒的基因组结构 | 第19页 |
| ·C 蛋白 | 第19-20页 |
| ·E~(rns) 蛋白 | 第20-22页 |
| ·E1 蛋白 | 第22页 |
| ·E2 蛋白 | 第22页 |
| ·CSFV 非结构蛋白 | 第22-24页 |
| ·猪瘟实验室诊断研究进展 | 第24-29页 |
| ·病毒抗原检测 | 第24-25页 |
| ·动物试验 | 第25页 |
| ·血清学诊断方法 | 第25-27页 |
| ·分子生物学方法 | 第27-29页 |
| ·猪瘟疫苗研究进展 | 第29-31页 |
| ·传统疫苗 | 第29页 |
| ·新型疫苗 | 第29-31页 |
| ·猪瘟防制研究进展 | 第31-32页 |
| ·毕氏酵母表达系统在动物传染病防治中的应用 | 第32-37页 |
| ·巴斯德毕氏酵母表达体系的特点 | 第33-36页 |
| ·巴斯德毕氏酵母表达体系在动物传染病中的应用 | 第36-37页 |
| ·甲醇酵母系统应用前景 | 第37页 |
| ·本课题的研究目的与意义 | 第37-39页 |
| 2 材料 | 第39-44页 |
| ·细菌、质粒载体与血清 | 第39页 |
| ·试验所需主要试剂 | 第39-40页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第40页 |
| ·试验所需培养基与主要溶液配制 | 第40-44页 |
| ·培养基的配置 | 第40-41页 |
| ·RNA 提取所用溶液 | 第41页 |
| ·质粒提取溶液的配置 | 第41页 |
| ·发酵产物处理溶液的配置 | 第41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE 蛋白电泳所用缓冲液 | 第42页 |
| ·Western-Blotting 所用溶液 | 第42-43页 |
| ·蛋白纯化所需溶液的配制 | 第43页 |
| ·间接ELISA 所用溶液的配制 | 第43-44页 |
| 3 方法 | 第44-58页 |
| ·猪瘟病毒基因E~(rns) 的克隆 | 第44-46页 |
| ·引物设计与合成 | 第44页 |
| ·猪瘟病毒总RNA 提取 | 第44页 |
| ·猪瘟E~(rns) 片段cDNA 的扩增 | 第44-45页 |
| ·PCR 扩增猪瘟E~(rns) 片段 | 第45页 |
| ·PCR 产物凝胶回收纯化 | 第45-46页 |
| ·克隆载体的构建与鉴定 | 第46-48页 |
| ·目的片段E~(rns)与pGM-T 载体的连接 | 第46页 |
| ·感受态细胞E.coli DH5α的制备 | 第46-47页 |
| ·连接产物转化感受态细胞D5Hα | 第47页 |
| ·阳性质粒提取鉴定 | 第47页 |
| ·酶切鉴定 | 第47-48页 |
| ·表达载体的构建与鉴定 | 第48-49页 |
| ·酶切回收目的片段E~(rns) | 第48页 |
| ·酶切回收表达载体pPIC9K | 第48页 |
| ·目的片段E~(rns) 与表达载体pPIC9K 的连接 | 第48页 |
| ·连接产物转化 | 第48-49页 |
| ·阳性表达载体的鉴定 | 第49页 |
| ·目的片端插入方向的鉴定 | 第49页 |
| ·重组酵母的构建与筛选 | 第49-51页 |
| ·重组酵母载体pPIC9K-E~(rns) 的线性化 | 第49-50页 |
| ·酵母感受态G5115 的制备 | 第50页 |
| ·酵母细胞的电转化 | 第50页 |
| ·重组酵母G5115 的G418 筛选 | 第50页 |
| ·重组酵母G5115 的菌落PCR 筛选 | 第50-51页 |
| ·利用MM 板筛选酵母甲醇利用型Mut~+与Mut~s | 第51页 |
| ·酵母中目的基因序列的鉴定 | 第51页 |
| ·重组酵母的发酵 | 第51-52页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 和Western-Blotting | 第52-54页 |
| ·重组酵母表达上清处理 | 第52页 |
| ·重组酵母表达菌体的处理 | 第52页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 及含量分析 | 第52-53页 |
| ·表达产物的Western-Blotting | 第53-54页 |
| ·重组蛋白E~(rns) 的纯化及SDS-PAGE 纯度鉴定 | 第54-56页 |
| ·蛋白的大量表达 | 第54-55页 |
| ·重组蛋白纯化预处理 | 第55页 |
| ·E~(rns) 蛋白纯化 | 第55页 |
| ·纯化后的E~(rns) 蛋白进行SDS-PAGE 纯度鉴定 | 第55页 |
| ·纯化E~(rns) 蛋白浓度的测定 | 第55-56页 |
| ·间接ELISA 方法的建立 | 第56-58页 |
| ·抗原包被浓度、抗体稀释倍数的确定 | 第56页 |
| ·临界值的确定 | 第56页 |
| ·特异性阻断试验 | 第56页 |
| ·交叉反应试验 | 第56-57页 |
| ·重复性试验 | 第57页 |
| ·灵敏度试验 | 第57页 |
| ·抗原包被板保存期的测定 | 第57页 |
| ·E~(rns)-ELISA 与CSFV Blocking-ELISA 试剂盒的符合率试验 | 第57页 |
| ·抗原包被板保存期的测定 | 第57-58页 |
| 4 结果与分析 | 第58-74页 |
| ·猪瘟病毒E~(rns) 基因的克隆 | 第58页 |
| ·E~(rns) 基因的T 克隆 | 第58-59页 |
| ·序列结果分析 | 第59-60页 |
| ·E~(rns) 基因密码子偏爱性分析 | 第60-62页 |
| ·E~(rns) 基因重组真核表达质粒的构建及鉴定 | 第62-63页 |
| ·pPIC9K-E~(rns) 整合到酵母基因组的方向鉴定 | 第63页 |
| ·重组酵母的构建与筛选 | 第63-65页 |
| ·菌落PCR 的鉴定 | 第65-66页 |
| ·酵母中目的基因的鉴定 | 第66页 |
| ·表达产物E~(rns) 蛋白的SDS-PAGE 分析 | 第66页 |
| ·表达产物的免疫印迹Western-Blotting 分析 | 第66-67页 |
| ·E~(rns) 蛋白纯化纯度结果 | 第67页 |
| ·纯化后E~(rns) 蛋白浓度 | 第67-68页 |
| ·E~(rns) 蛋白纯化收集图谱 | 第68页 |
| ·ELISA 最佳工作条件的确定 | 第68-74页 |
| ·抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 | 第68-69页 |
| ·重组E~(rns) 蛋白抗原的包被条件的确定 | 第69页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第69页 |
| ·血清和酶标二抗反应时间的确定 | 第69-70页 |
| ·间接 ELISA 方法阴阳性临界值的确定 | 第70页 |
| ·ELISA 特异性阻断试验 | 第70页 |
| ·ELISA 交叉反应试验 | 第70-71页 |
| ·间接ELISA 的重复性 | 第71-73页 |
| ·符合性试验 | 第73页 |
| ·保存性试验 | 第73-74页 |
| 5 讨论 | 第74-79页 |
| ·猪瘟病毒E~(rns) 基因的克隆与表达 | 第74-75页 |
| ·E~(rns) 蛋白 | 第74页 |
| ·毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K | 第74页 |
| ·基因整合方式和筛选方式 | 第74-75页 |
| ·毕赤酵母真核表达系统 | 第75页 |
| ·猪瘟E~(rns) 蛋白在毕氏酵母中的表达 | 第75-76页 |
| ·蛋白的表达形式 | 第76-77页 |
| ·Western-Blotting 分析 | 第77页 |
| ·E~(rns) 蛋白的纯化 | 第77页 |
| ·E~(rns)-ELISA 的建立和优化 | 第77-79页 |
| 6 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 在读期间发表论文 | 第88-89页 |
| 作者简介 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
