| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 第一章 引言 | 第19-33页 |
| 1.1 纤维素及半纤维素 | 第19-21页 |
| 1.1.1 纤维素 | 第19-20页 |
| 1.1.2 半纤维素 | 第20-21页 |
| 1.2 纤维素酶及其研究进展 | 第21-25页 |
| 1.2.1 纤维素酶 | 第21页 |
| 1.2.2 β-jelly-roll结构 | 第21-22页 |
| 1.2.3 GH12 糖苷水解酶及其研究进展 | 第22-25页 |
| 1.3 α/β家族酶多催化反应功能的研究进展 | 第25-27页 |
| 1.4 GH45 纤维素酶及其研究进展 | 第27-29页 |
| 1.4.1 GH45 纤维素酶热稳定性的研究进展 | 第27-28页 |
| 1.4.2 GH45 纤维素酶抗表面活性剂的研究进展 | 第28-29页 |
| 1.5 蛋白质工程理论 | 第29-32页 |
| 1.5.1 背景简介 | 第29-30页 |
| 1.5.2 蛋白质的稳定性 | 第30-31页 |
| 1.5.3 蛋白质与底物的结合与催化 | 第31-32页 |
| 1.6 本研究的目的与意义 | 第32-33页 |
| 第二章 GH45 纤维素酶TaCel45 的热稳定性的研究 | 第33-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-35页 |
| 2.1.1 菌株、质粒 | 第33页 |
| 2.1.2 引物合成及测序 | 第33页 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 | 第33页 |
| 2.1.4 培养基及试剂的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第34-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-42页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第35页 |
| 2.2.2 TaCel45 全长基因的获得 | 第35-36页 |
| 2.2.3 TaCel45编码基因的获得 | 第36-37页 |
| 2.2.4 重组表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.2.5 突变体的构建 | 第38页 |
| 2.2.6 重组GH45 纤维素酶的表达和纯化 | 第38-40页 |
| 2.2.7 重组葡聚糖酶的酶学性质测定 | 第40-41页 |
| 2.2.8 野生酶和突变酶的T_m值测定 | 第41-42页 |
| 2.2.9 野生型和突变体在酵母中拷贝数的测定 | 第42页 |
| 2.2.10 TaCel45 的同源建模及分子动力学模拟 | 第42页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第42-53页 |
| 2.3.1 T.arenaria XZ7 来源的TaCel45 的基因序列和三维结构分析 | 第42-44页 |
| 2.3.2 纤维素酶TaCel45 的表达、纯化及性质测定 | 第44-47页 |
| 2.3.3 TaCel45 与其它GH45 纤维素酶的性质比较 | 第47-49页 |
| 2.3.4 TaCel45 的热动力学分析 | 第49页 |
| 2.3.5 TaCel45 的动力学分析 | 第49-50页 |
| 2.3.6 TaCel45 关于二硫键的突变体构建及表达 | 第50-51页 |
| 2.3.7 TaCel45 及其突变体在毕赤酵母中基因拷贝数的测定 | 第51-52页 |
| 2.3.8 TaCel45与TaCel45-C12S二级结构的测定 | 第52页 |
| 2.3.9 TaCel45-C12S性质的测定 | 第52-53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-54页 |
| 本章小结 | 第54-55页 |
| 第三章 GH12 纤维素酶NfEG12A中 loop3 的功能研究 | 第55-72页 |
| 3.1 实验材料 | 第55-56页 |
| 3.1.1 实验菌株和质粒 | 第55页 |
| 3.1.2 实验试剂和仪器 | 第55页 |
| 3.1.3 引物合成和核酸测序 | 第55页 |
| 3.1.4 培养基 | 第55-56页 |
| 3.2 实验方法 | 第56-60页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第56页 |
| 3.2.2 编码NfEG12A基因cDNA的获得 | 第56-57页 |
| 3.2.3 重组表达载体的构建 | 第57页 |
| 3.2.4 突变体质粒的构建 | 第57页 |
| 3.2.5 野生酶和突变酶的表达和纯化 | 第57-58页 |
| 3.2.6 重组葡聚糖酶的酶学性质测定 | 第58页 |
| 3.2.7 动力学参数的测定 | 第58页 |
| 3.2.8 NfEG12A及其突变体水解纤维六糖的催化效率的测定 | 第58-59页 |
| 3.2.9 NfEG12A及其突变体水解葡聚糖的产物分析 | 第59页 |
| 3.2.10 NfEG12A及其突变体二级结构的分析 | 第59页 |
| 3.2.11 野生酶与突变体的同源建模、分子对接及动力学分析 | 第59-60页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第60-70页 |
| 3.3.1 N.fischeri P1 来源的NfEG12A的基因序列和三维结构分析 | 第60页 |
| 3.3.2 NfEG12A及其突变体的构建、纯化和表达 | 第60-61页 |
| 3.3.3 NfEG12A与其他GH12 葡聚糖酶序列的比较 | 第61页 |
| 3.3.4 NfEG12A与其他GH12 葡聚糖酶的性质比较 | 第61-63页 |
| 3.3.5 NfEG12A及其突变体二级结构的测定 | 第63页 |
| 3.3.6 NfEG12A及其突变体的基本性质分析 | 第63-65页 |
| 3.3.7 NfEG12A及其突变体的底物特异性的测定 | 第65页 |
| 3.3.8 NfEG12A及其突变体水解纤维六糖产物的测定 | 第65-67页 |
| 3.3.9 NfEG12A、EG及其突变体的分子动力学模拟数据分析 | 第67-70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-71页 |
| 本章小结 | 第71-72页 |
| 第四章 关于GH12 家族酶多底物催化特性的突变及结构研究 | 第72-87页 |
| 4.1 实验材料 | 第72页 |
| 4.1.1 实验菌株和质粒 | 第72页 |
| 4.1.2 实验试剂和仪器 | 第72页 |
| 4.1.3 引物合成和核酸测序 | 第72页 |
| 4.1.4 培养基 | 第72页 |
| 4.2 实验方法 | 第72-75页 |
| 4.2.1 基因克隆与突变体的构建 | 第72-73页 |
| 4.2.2 序列分析 | 第73页 |
| 4.2.3 野生酶和突变酶的表达与纯化 | 第73-74页 |
| 4.2.4 基本酶学性质测定 | 第74页 |
| 4.2.5 葡聚糖酶和木葡聚糖酶的动力学常数的测定 | 第74页 |
| 4.2.6 酶水解葡聚糖和木葡聚糖的产物分析 | 第74页 |
| 4.2.7 蛋白晶体结构解析和数据整理 | 第74-75页 |
| 4.2.8 分子对接和动力学模拟 | 第75页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第75-84页 |
| 4.3.1 N.fischeri P1 来源的NfXyG12A的基因序列和三维结构分析 | 第75-76页 |
| 4.3.2 鉴别与葡聚糖酶和木葡聚糖酶活性相关的氨基酸位点 | 第76-78页 |
| 4.3.3 替换氨基酸位点提高木葡聚糖酶活性的突变体 | 第78-80页 |
| 4.3.4 野生型及其突变体的构建、纯化和表达 | 第80页 |
| 4.3.5 野生酶与突变酶的动力学参数测定 | 第80-81页 |
| 4.3.6 突变体对两类底物的水解产物没有改变 | 第81页 |
| 4.3.7 NfEG12A与 NfEG12A-N18Y的晶体结构解析 | 第81-84页 |
| 4.3.8 残基的部分识别和结合导致葡聚糖酶和木葡聚糖酶活性的差异 | 第84页 |
| 4.4 讨论 | 第84-86页 |
| 本章小结 | 第86-87页 |
| 第五章 关于羟基乙腈裂解酶和酯酶的多催化反应机制研究 | 第87-107页 |
| 5.1 实验材料 | 第87-88页 |
| 5.1.1 菌株、质粒 | 第87页 |
| 5.1.2 引物合成及测序 | 第87页 |
| 5.1.3 试剂及试剂盒 | 第87页 |
| 5.1.4 培养基及试剂的配制 | 第87-88页 |
| 5.1.5 主要仪器 | 第88页 |
| 5.2 实验方法 | 第88-91页 |
| 5.2.1 基因合成与克隆 | 第88页 |
| 5.2.2 蛋白的诱导表达与纯化 | 第88页 |
| 5.2.3 羟基乙腈裂解酶活性的测定 | 第88-89页 |
| 5.2.4 酯酶活性的测定 | 第89页 |
| 5.2.5 同时反应 | 第89页 |
| 5.2.6 采用pH指示剂法测定酶水解不同酯类的活性 | 第89-90页 |
| 5.2.7 抑制常数的测定 | 第90页 |
| 5.2.8 氢氘交换质谱验证酯酶和羟基乙腈裂解酶的柔性差异 | 第90-91页 |
| 5.3 结果与分析 | 第91-104页 |
| 5.3.1 鉴定酯酶(EST)和羟基乙腈裂解酶(HNL)中保守的残基 | 第91-93页 |
| 5.3.2 替换HNL1 中的保守残基可以增强酯酶的活性 | 第93-94页 |
| 5.3.3 位于催化腔洞附近的残基是底物识别结合的关键氨基酸位点 | 第94页 |
| 5.3.4 替换第一催化半球的所有残基并没有改变酶的活性 | 第94-97页 |
| 5.3.5 突变体HNL1_1~(st)+2~(nd)16 residues更易于结合酯类的底物 | 第97-99页 |
| 5.3.6 突变体HNL1_1~(st)+2~(nd)16 residues的底物结合口袋的朝向发生改变 | 第99-100页 |
| 5.3.7 突变体HNL1_1~(st)+2~(nd)16 residues对苯甲酸的抑制常数提高了 | 第100-102页 |
| 5.3.8 氢氘交换质谱(HDX)验证EST与 HNL的柔性区域 | 第102-103页 |
| 5.3.9 蛋白结构统计软件预测EST与 HNL波动大的位点 | 第103-104页 |
| 5.4 讨论 | 第104-106页 |
| 本章小结 | 第106-107页 |
| 第六章 全文结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-119页 |
| 附录 | 第119-120页 |
| 致谢 | 第120-122页 |
| 作者简历 | 第122页 |
