| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第1章 引言 | 第13-38页 |
| 1.1 研究背景 | 第13-22页 |
| 1.1.1 抗生素的作用 | 第13-17页 |
| 1.1.2 抗生素的发展 | 第17-20页 |
| 1.1.3 抗致病力策略的兴起 | 第20-22页 |
| 1.2 酪蛋白水解酶ClpP作为抗菌靶标的研究概况 | 第22-35页 |
| 1.2.1 ClpP的发现及功能 | 第22-26页 |
| 1.2.2 ClpP小分子抑制剂的发展 | 第26-30页 |
| 1.2.3 ClpP小分子激动剂的发展 | 第30-35页 |
| 1.3 本论文拟解决关键科学问题与预期目标 | 第35-38页 |
| 1.3.1 科学问题 | 第35-36页 |
| 1.3.2 预期目标 | 第36-38页 |
| 第2章 SaClpP小分子抑制剂的抗毒力研究 | 第38-65页 |
| 2.1 实验材料 | 第38-44页 |
| 2.1.1 实验用质粒、菌株 | 第38页 |
| 2.1.2 实验所用试剂 | 第38-40页 |
| 2.1.3 实验所用仪器 | 第40-41页 |
| 2.1.4 实验用培养基试剂配制 | 第41-44页 |
| 2.2 实验方法 | 第44-49页 |
| 2.2.1 ClpP/ClpX/GFP-SsrA 蛋白表达 | 第44-45页 |
| 2.2.2 ClpP/ClpX/GFP-SsrA 蛋白纯化 | 第45页 |
| 2.2.3 构建 ClpPS98A 突变 | 第45页 |
| 2.2.4 突变体 ClpPS98A 蛋白表达纯化 | 第45页 |
| 2.2.5 ClpP(无标签)蛋白表达纯化 | 第45-46页 |
| 2.2.6 高通量筛选小分子抑制剂 | 第46页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE 验证抑制剂活性 | 第46页 |
| 2.2.8 检测抑制剂IC50值 | 第46-47页 |
| 2.2.9 Pull down 实验 | 第47页 |
| 2.2.10 肌酸激酶实验 | 第47页 |
| 2.2.11 ClpX/ATPase 实验 | 第47-48页 |
| 2.2.12 差异荧光扫描实验 | 第48页 |
| 2.2.13 ClpP自身酶解活性实验 | 第48页 |
| 2.2.14 溶血酶及蛋白水解酶活性检测 | 第48-49页 |
| 2.2.15 蛋白聚集状态分析 | 第49页 |
| 2.3 实验结果 | 第49-64页 |
| 2.3.1 ClpP/ClpX/GFP-SsrA 蛋白纯化 | 第49-50页 |
| 2.3.2 ClpPS98A 定点突变及蛋白纯化 | 第50-51页 |
| 2.3.3 ClpP(无标签)蛋白纯化 | 第51-52页 |
| 2.3.4 基于FI筛选小分子抑制剂 | 第52-53页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE 验证抑制剂活性 | 第53-54页 |
| 2.3.6 FI/SDS-PAGE 测抑制剂IC_(50)值 | 第54-55页 |
| 2.3.7 抑制剂破坏ClpXP相互作用 | 第55-57页 |
| 2.3.8 抑制剂不影响ATP的生成 | 第57-58页 |
| 2.3.9 抑制剂与ClpX无直接作用 | 第58-59页 |
| 2.3.10 抑制剂不影响ClpP肽段酶活性 | 第59页 |
| 2.3.11 抑制剂29307使ClpP蛋白不稳定 | 第59-60页 |
| 2.3.12 抑制剂不影响溶血酶及蛋白水解酶活性 | 第60-62页 |
| 2.3.13 抑制剂不改变蛋白聚集状态 | 第62-64页 |
| 2.4 总结与讨论 | 第64-65页 |
| 第3章 直接靶向SaClpP的新型抗生素研究 | 第65-96页 |
| 3.1 实验材料 | 第65-67页 |
| 3.1.1 实验用质粒和菌株 | 第65页 |
| 3.1.2 实验用试剂 | 第65-66页 |
| 3.1.3 实验用仪器 | 第66页 |
| 3.1.4 实验用培养基试剂配制 | 第66-67页 |
| 3.2 实验方法 | 第67-72页 |
| 3.2.1 FtsZ蛋白表达与纯化 | 第67页 |
| 3.2.2 高通量筛选小分子激动剂 | 第67-68页 |
| 3.2.3 候选化合物激动活性确证 | 第68页 |
| 3.2.4 测定候选化合物EC_(50)值 | 第68页 |
| 3.2.5 ClpXP 相互作用降解 GFP-SsrA | 第68-69页 |
| 3.2.6 构建过表达clpP菌株 | 第69页 |
| 3.2.7 最小抑菌浓度实验(MIC) | 第69-70页 |
| 3.2.8 细菌生长曲线的测定 | 第70页 |
| 3.2.9 持留实验 | 第70页 |
| 3.2.10 差异荧光扫描实验(DSF) | 第70-71页 |
| 3.2.11 细菌内热稳定迁移实验 | 第71页 |
| 3.2.12 细菌内FtsZ降解实验 | 第71页 |
| 3.2.13 Western blot 实验 | 第71-72页 |
| 3.2.14 蛋白小分子共结晶培养及结构解析 | 第72页 |
| 3.3 实验结果 | 第72-95页 |
| 3.3.1 FtsZ蛋白纯化 | 第72-73页 |
| 3.3.2 基于FI筛选小分子激动剂 | 第73-74页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE 验证小分子激动活性 | 第74-75页 |
| 3.3.4 化合物C2E02的EC_(50)值 | 第75-76页 |
| 3.3.5 C2E02衍生物的激动活性 | 第76-77页 |
| 3.3.6 DA系列化合物的EC_(50)值 | 第77-80页 |
| 3.3.7 DA 系列化合物抑制 ClpXP 相互作用 | 第80-81页 |
| 3.3.8 DA系列化合物抑菌活性结果 | 第81-84页 |
| 3.3.9 DA20/DA23/DA27抑制细菌的生长 | 第84-85页 |
| 3.3.10 DA20/DA23/DA27可以抗持留菌 | 第85-86页 |
| 3.3.11 DA 系列化合物增加ClpP蛋白热稳定性 | 第86-90页 |
| 3.3.12 DA20/DA27 增加胞内 SaClpP 稳定性 | 第90-91页 |
| 3.3.13 DA20/DA23/DA27激动胞内 SaClpP 降解SaFtsZ | 第91-92页 |
| 3.3.14 DA23与ClpP共晶结构解析 | 第92-95页 |
| 3.4 总结与讨论 | 第95-96页 |
| 第4章 抗菌小分子的靶向性研究 | 第96-119页 |
| 4.1 实验材料 | 第96-97页 |
| 4.1.1 实验用质粒、菌株 | 第96页 |
| 4.1.2 实验所用试剂 | 第96-97页 |
| 4.1.3 实验所用仪器 | 第97页 |
| 4.1.4 实验用试剂配制 | 第97页 |
| 4.2 实验方法 | 第97-104页 |
| 4.2.1 最小抑菌浓度实验 | 第97-98页 |
| 4.2.2 持留实验 | 第98页 |
| 4.2.3 MWP446活性检测 | 第98页 |
| 4.2.4 蛋白质组学实验 | 第98-99页 |
| 4.2.5 筛选抗性突变菌株 | 第99页 |
| 4.2.6 突变菌株抗性验证 | 第99-100页 |
| 4.2.7 提取细菌基因组 | 第100页 |
| 4.2.8 基因组测序 | 第100页 |
| 4.2.9 构建ClpP点突变 | 第100-101页 |
| 4.2.10 构建clpP突变菌株 | 第101页 |
| 4.2.11 ClpPG69R突变体蛋白表达纯化 | 第101页 |
| 4.2.12 ClpPG69R蛋白活性表征 | 第101-102页 |
| 4.2.13 ClpPG69R的蛋白水解活性 | 第102页 |
| 4.2.14 ClpPG69R蛋白晶体培养及优化 | 第102页 |
| 4.2.15 Co-IP实验 | 第102-104页 |
| 4.2.16 构建 lysA、uvrB连续性表达质粒 | 第104页 |
| 4.3 实验结果 | 第104-117页 |
| 4.3.1 MWP446抑菌具有ClpP相关性 | 第104-106页 |
| 4.3.2 MWP446不抗持留菌 | 第106页 |
| 4.3.3 MWP446不激动也不抑制ClpP | 第106-107页 |
| 4.3.4 蛋白质组学发现MWP446可能相关靶点 | 第107-108页 |
| 4.3.5 突变菌株对MWP446抗性增加 | 第108-110页 |
| 4.3.6 基因组测序结果 | 第110页 |
| 4.3.7 突变回补菌株抗性增加 | 第110-112页 |
| 4.3.8 ClpPG69R水解活性减弱 | 第112-113页 |
| 4.3.9 MWP446不影响ClpPG69R的活性 | 第113-114页 |
| 4.3.10 ClpPG69R蛋白晶体 | 第114-115页 |
| 4.3.11 MWP446作用靶点分析 | 第115-116页 |
| 4.3.12 MWP446不影响lysA/uvrB突变菌株抗性 | 第116-117页 |
| 4.4 总结与讨论 | 第117-119页 |
| 第5章 新骨架抗菌小分子活性研究 | 第119-127页 |
| 5.1 实验材料 | 第119-120页 |
| 5.1.1 实验用菌株、细胞 | 第119页 |
| 5.1.2 实验所用试剂 | 第119页 |
| 5.1.3 实验所用仪器 | 第119-120页 |
| 5.1.4 实验用试剂配制 | 第120页 |
| 5.2 实验方法 | 第120-121页 |
| 5.2.1 最小抑菌浓度实验 | 第120页 |
| 5.2.2 细胞毒性实验 | 第120-121页 |
| 5.2.3 药代动力学实验 | 第121页 |
| 5.3 实验结果 | 第121-125页 |
| 5.3.1 四氢咔唑类化合物具有抗菌活性 | 第121-124页 |
| 5.3.2 化合物12c/12i/12j具有细胞毒性 | 第124页 |
| 5.3.3 化合物12c药代动力学结果 | 第124-125页 |
| 5.4 总结与讨论 | 第125-127页 |
| 第6章 结论与展望 | 第127-131页 |
| 6.1 结论 | 第127-128页 |
| 6.1.1 小分子破坏蛋白相互作用抑制细菌毒力 | 第127页 |
| 6.1.2 小分子直接靶向SaClpP激动杀菌 | 第127页 |
| 6.1.3 小分子抗菌靶向性探究 | 第127-128页 |
| 6.1.4 发展新型抗菌小分子化合物 | 第128页 |
| 6.2 展望 | 第128-131页 |
| 参考文献 | 第131-141页 |
| 附录：缩略词列表 | 第141-143页 |
| 致谢 | 第143-145页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第145页 |
