| 中文摘要 | 第12-13页 |
| ABSTRACT | 第13-14页 |
| 缩写词表 | 第15-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-31页 |
| 1 转基因技术的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.1 常用的转基因技术方法及意义 | 第17-18页 |
| 1.1.1 农杆菌介导的基因转化 | 第17-18页 |
| 1.1.2 DNA直接转化 | 第18页 |
| 1.2 转基因技术的优缺点 | 第18-19页 |
| 2 病毒诱导基因沉默（VIGS）体系的研究进展 | 第19-23页 |
| 2.1 VIGS的发现 | 第19-20页 |
| 2.2 VIGS沉默机制 | 第20-21页 |
| 2.3 病毒诱导基因沉默的操作规程 | 第21-22页 |
| 2.4 病毒诱导基因沉默体系与基因功能验证 | 第22-23页 |
| 2.5 病毒诱导基因沉默技术的优缺点 | 第23页 |
| 3 植物对低温胁迫的生理及分子生物学适应机制的研究进展 | 第23-26页 |
| 3.1 植物在低温胁迫下的生理反应 | 第23-26页 |
| 3.1.1 低温对植物膜系统的影响 | 第23-24页 |
| 3.1.2 低温对植物体内渗透调节物质的影响 | 第24-25页 |
| 3.1.3 低温对植物体内抗氧化酶系统的影响 | 第25-26页 |
| 3.2 植物响应低温的分子机制 | 第26页 |
| 4 高山离子芥的研究概述 | 第26-27页 |
| 5 磷脂酶D(PLD)的研究进展 | 第27-29页 |
| 5.1 PLD的分类及其结构特点 | 第28页 |
| 5.2 PLD的组织分布 | 第28页 |
| 5.3 PLD的活性受Ca2+、pH、G蛋白的调控 | 第28-29页 |
| 5.4 PLD调控植物抗逆性的作用机理 | 第29页 |
| 6 研究目的及意义 | 第29-31页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第31-48页 |
| 第一节 农杆菌介导的高山离子芥CbPLDδ基因转化烟草 | 第31-39页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| 1.1 植物材料培养 | 第31页 |
| 1.2 菌株与载体 | 第31页 |
| 1.3 载体 | 第31页 |
| 1.4 酶及各种生化试剂 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-39页 |
| 2.1 CbPLDδ 基因植物表达载体的构建 | 第32-35页 |
| 2.1.1 目的片段的扩增 | 第32-33页 |
| 2.1.2 目的片段的回收 | 第33页 |
| 2.1.3 TA克隆 | 第33-34页 |
| 2.1.4 连接产物的转化及阳性克隆的鉴定 | 第34页 |
| 2.1.5 阳性克隆的序列测定 | 第34页 |
| 2.1.6 PTG19-T-PLDδ质粒DNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.1.7 PTG19-T-PLDδ质粒DNA的酶切 | 第35页 |
| 2.2 表达载体的制备 | 第35页 |
| 2.3 植物表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.3.1 植物表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.4 农杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.4.1 卡那霉素(Kan)选择压的确定 | 第36页 |
| 2.4.2 羧卞青霉素（Car）浓度的确定 | 第36-37页 |
| 2.4.3 冻融法转化农杆菌 | 第37页 |
| 2.5 浸染液的制备 | 第37-38页 |
| 2.5.1 MS培养基的制备 | 第37页 |
| 2.5.2 叶盘法转化烟草 | 第37-38页 |
| 2.5.3 抗性愈伤组织的筛选及出芽诱导 | 第38页 |
| 2.5.4 转化植株的生根培养和移栽 | 第38页 |
| 2.6 转基因烟草植株的检测 | 第38-39页 |
| 2.6.1 DNA的提取 | 第38页 |
| 2.6.2 PCR检测 | 第38-39页 |
| 第二节 烟草脆裂病毒(TRV)介导的转基因烟草中CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ基因的沉默 | 第39-42页 |
| 1 实验材料 | 第39页 |
| 1.1 植物材料的培养 | 第39页 |
| 1.2 菌株与载体 | 第39页 |
| 2 实验方法 | 第39-42页 |
| 2.1 病毒表达载体TRV-CbPLDα、TRV-CbPLDβ、TRV-CbPLDδ的构建 | 第39-40页 |
| 2.1.1 CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ目的片段的扩增 | 第39-40页 |
| 2.1.2 TRV载 体质粒和PTG19T-CbPLDα、PTG19T-CbPLDβ、PTG19T-CbPLDδ质粒的抽提及双酶切 | 第40页 |
| 2.1.3 粘性末端的连接 | 第40页 |
| 2.2 冻融法转化农杆菌 | 第40页 |
| 2.3 侵染液的制备 | 第40-41页 |
| 2.3.1 农杆菌的渗入 | 第40-41页 |
| 2.4 TRV介导的转基因烟草基因沉默的实时荧光定量PCR检测 | 第41-42页 |
| 第三节 低温胁迫对转基因烟草中CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ基因表达的影响 | 第42-43页 |
| 1 试验材料 | 第42页 |
| 1.1 植物材料的培养 | 第42页 |
| 2 实验方法 | 第42-43页 |
| 第四节 低温胁迫对转基因烟草及病毒介导的基因沉默TRV-CbPLD烟草生理生化代谢调控作用的影响 | 第43-48页 |
| 1 实验材料 | 第43页 |
| 1.1 植物材料的培养 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-48页 |
| 2.1 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草膜系统伤害程度指标的测定 | 第43-44页 |
| 2.1.1 相对电导率（REC）的测定 | 第43-44页 |
| 2.1.2 丙二醛（MDA）含量的测定 | 第44页 |
| 2.2 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草渗透调节物质含量的测定 | 第44-45页 |
| 2.2.1 脯氨酸（Pro）含量的测定（磺基水杨酸法测定） | 第44-45页 |
| 2.2.2 可溶性糖（SS）含量的测定 | 第45页 |
| 2.2.3 考马斯亮蓝Ｇ-250法测定可溶性蛋白（SP）的含量 | 第45页 |
| 2.3 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草抗氧化酶系的测定 | 第45-48页 |
| 2.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定（氮蓝四唑法） | 第45-46页 |
| 2.3.2 过氧化物酶（POD）活性的测定（愈创木酚显色法） | 第46页 |
| 2.3.3 过氧化氢酶（CAT）活性的测定 | 第46-47页 |
| 2.3.4 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 | 第47-48页 |
| 第三章 农杆菌介导的CbPLDδ基因转化烟草 | 第48-54页 |
| 1 结果分析 | 第48-53页 |
| 1.1 CbPLDδ基因植物表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 1.2 植物表达载体pBI-PLDδ导入农杆菌 | 第50页 |
| 1.3 转基因烟草的获得 | 第50-52页 |
| 1.3.1 抗性筛选压的确定 | 第50-51页 |
| 1.3.2 抗生素抑菌浓度的确定 | 第51页 |
| 1.3.3 转基因烟草的获得 | 第51-52页 |
| 1.4 转基因烟草的检测 | 第52-53页 |
| 2 讨论 | 第53-54页 |
| 第四章 TRV介导的转基因烟草中CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ基因的沉默 | 第54-62页 |
| 1 结果分析 | 第54-61页 |
| 1.1 CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ基因病毒表达载体的构建 | 第55-58页 |
| 1.2 病毒表达载体TRV-CbPLDα、TRV-CbPLDβ、TRV-CbPLDδ 导入农杆菌 | 第58页 |
| 1.3 TRV表达载体TRV-CbPLDα、TRV-CbPLDβ、TRV-CbPLDδ侵染转基因烟草 | 第58-59页 |
| 1.4 TRV介导的转基因烟草基因沉默的实时荧光定量PCR检测 | 第59-61页 |
| 2 讨论 | 第61-62页 |
| 第五章 转基因烟草中CbPLDα、CbPLDβ、CbPLDδ基因在低温胁迫下的功能研究 | 第62-65页 |
| 1 结果与分析 | 第62-63页 |
| 1.1 转CbPLDα基因烟草中CbPLDα基因表达的实时荧光定量分析 | 第62页 |
| 1.2 转CbPLDβ基因烟草中CbPLDβ基因表达的实时荧光定量分析 | 第62-63页 |
| 1.3 转CbPLDδ基因烟草中CbPLDδ基因表达的实时荧光定量分析 | 第63页 |
| 2 讨论 | 第63-65页 |
| 第六章 低温胁迫下转基因烟草及烟草脆裂病毒（TRV）介导的基因沉默烟草（TRV-CbPLD）生理生化代谢调控作用的研究 | 第65-85页 |
| 1 结果与分析 | 第65-80页 |
| 1.1 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片膜系统伤害程度指标的测定 | 第65-68页 |
| 1.1.1 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片相对电导率的影响 | 第65-66页 |
| 1.1.2 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片丙二醛（MDA）含量的影响 | 第66-68页 |
| 1.2 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片渗透调节物质含量的测定 | 第68-73页 |
| 1.2.1 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片脯氨酸（Pro）含量的影响 | 第68-70页 |
| 1.2.2 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片可溶性糖（SS）含量的影响 | 第70-71页 |
| 1.2.3 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片可溶性蛋白（SP）含量的影响 | 第71-73页 |
| 1.3 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片抗氧化酶系的测定57 | 第73-80页 |
| 1.3.1 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 | 第73-75页 |
| 1.3.2 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片过氧化物酶（POD）活性的影响 | 第75-76页 |
| 1.3.3 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响 | 第76-78页 |
| 1.3.4 低温胁迫对转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片抗坏血酸过氧化物酶(APX)的影响 | 第78-80页 |
| 2 讨论 | 第80-85页 |
| 2.1 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片膜脂过氧化程度的变化 | 第80-81页 |
| 2.2 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片渗透调节物质含量的变化 | 第81-82页 |
| 2.3 低温胁迫下转基因烟草及TRV-CbPLD烟草叶片抗氧化酶活性的变化 | 第82-85页 |
| 第七章 结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-99页 |
| 研究生期间发表的学术论文 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100页 |
