| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第8-17页 |
| 1.1 甾体化合物 | 第8-10页 |
| 1.1.1 甾体化合物的结构 | 第8页 |
| 1.1.2 甾体化合物的功能及分类 | 第8-9页 |
| 1.1.3 甾体化合物合成研究简史 | 第9-10页 |
| 1.2 甾体化合物的微生物转化 | 第10-12页 |
| 1.2.1 甾体微生物转化的研究进展 | 第10页 |
| 1.2.2 甾体微生物转化的优点 | 第10-11页 |
| 1.2.3 甾体微生物转化的主要类型 | 第11-12页 |
| 1.3 甾体羟基化反应及P450基因的异源表达 | 第12-14页 |
| 1.3.1 丝状真菌甾体羟化酶及其基因研究现状 | 第12-13页 |
| 1.3.2 P450基因的常用异源表达系统 | 第13-14页 |
| 1.4 脉孢菌的生物学特性及作为载体羟化酶表达宿主的可行性 | 第14-15页 |
| 1.5 本课题的立题背景和意义 | 第15-16页 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 | 第16-17页 |
| 1.6.1 研究对象 | 第16页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第16-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-24页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 工具酶及实验试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.3 实验仪器及设备 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要溶液及缓冲液 | 第20-22页 |
| 2.1.5 培养基 | 第22-24页 |
| 2.1.6 甾体底物及展开剂 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-42页 |
| 2.2.1 脉孢菌甾体转化实验 | 第24页 |
| 2.2.2 脉孢菌甾体转化诱导与非诱导对比实验 | 第24页 |
| 2.2.3 裂解法提取脉孢菌基因组 | 第24-25页 |
| 2.2.4 脉孢菌总RNA的提取及纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.5 cDNA的合成 | 第26页 |
| 2.2.6 沃氏底物诱导的P450基因的克隆 | 第26-29页 |
| 2.2.7 沃氏底物诱导的P450基因表达载体的构建 | 第29-35页 |
| 2.2.8 酿酒酵母和毕赤酵母的遗传转化 | 第35-37页 |
| 2.2.9 P450基因重组酵母转化子的筛选与鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.10 P450基因重组酵母的甾体转化 | 第38页 |
| 2.2.11 P450基因重组酵母转化沃氏HPLC分析 | 第38-39页 |
| 2.2.12 NCU05001敲除载体的构建 | 第39-41页 |
| 2.2.13 脉孢菌的电转化 | 第41页 |
| 2.2.14 敲除突变株的筛选 | 第41-42页 |
| 3 结果与讨论 | 第42-57页 |
| 3.1 脉孢菌转化沃氏、双酮及4-AD的TLC分析 | 第42页 |
| 3.2 脉孢菌甾体底物诱导与非诱导对比实验 | 第42-43页 |
| 3.3 脉孢菌总RNA的提取 | 第43-44页 |
| 3.4 P450酶基因的克隆及诱导性分析 | 第44-46页 |
| 3.4.1 PCR克扩增P450酶基因 | 第44页 |
| 3.4.2 P450酶基因克隆载体的构建 | 第44-46页 |
| 3.5 P450基因的酿酒酵母表达载体的构建 | 第46页 |
| 3.6 酿酒酵母的遗传转化 | 第46-47页 |
| 3.7 P450基因重组酿酒酵母转化产物的TLC分析 | 第47页 |
| 3.8 P450酶基因的诱导性分析 | 第47-48页 |
| 3.9 NCU05001毕赤酵母表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.10 毕赤酵母的遗传转化 | 第49-50页 |
| 3.11 重组毕赤酵母转化沃氏产物的TLC分析 | 第50页 |
| 3.12 重组毕赤酵母转化沃氏产物的HPLC分析 | 第50-52页 |
| 3.13 重组毕赤酵母转化4-AD产物的TLC分析 | 第52-53页 |
| 3.14 重组毕赤酵母转化4-AD产物的HPLC分析 | 第53-54页 |
| 3.15 脉孢菌NCU05001敲除载体的构建 | 第54-57页 |
| 4 结论 | 第57-58页 |
| 5 展望 | 第58-59页 |
| 6 参考文献 | 第59-64页 |
| 7 论文发表情况 | 第64-65页 |
| 8 致谢 | 第65页 |
