| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 符号和缩写 | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-23页 |
| 1.1 miRNA的研究进展 | 第12-21页 |
| 1.1.1 miRNA的概念 | 第12页 |
| 1.1.2 miRNA的特点 | 第12-13页 |
| 1.1.3 miRNA的生物合成 | 第13页 |
| 1.1.4 miRNA的作用机制 | 第13-14页 |
| 1.1.5 植物miRNA的功能 | 第14-18页 |
| 1.1.5.1 miRNA与植物的形态建成及发育进程 | 第14-15页 |
| 1.1.5.2 miRNA与逆境胁迫 | 第15-17页 |
| 1.1.5.3 miRNA与植物激素调节及信号转导 | 第17页 |
| 1.1.5.4 miRNA自身代谢反馈调节 | 第17-18页 |
| 1.1.6 miRNA的研究方法 | 第18-20页 |
| 1.1.6.1 miRNA的获得 | 第18-19页 |
| 1.1.6.2 miRNA的表达分析方法 | 第19-20页 |
| 1.1.7 miRNA靶基因的预测与验证 | 第20-21页 |
| 1.2 植物原生质体分离与培养 | 第21-22页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.2 实验试剂 | 第23页 |
| 2.3 实验仪器 | 第23页 |
| 2.4 实验方法 | 第23-35页 |
| 2.4.1 材料的准备 | 第23-24页 |
| 2.4.2 原生质体的分离纯化 | 第24页 |
| 2.4.3 椪柑愈伤组织与原生质体总RNA的提取 | 第24-26页 |
| 2.4.4 RNA的检测 | 第26页 |
| 2.4.4.1 非变性琼脂糖凝胶电泳检测 | 第26页 |
| 2.4.4.2 紫外分光光度计检测 | 第26页 |
| 2.4.4.3 RT-PCR检验 | 第26页 |
| 2.4.5 椪柑愈伤组织与原生质体样本小RNA测序与生物信息学分析 | 第26-29页 |
| 2.4.5.1 椪柑愈伤组织与原生质体样本小RNA测序 | 第26-27页 |
| 2.4.5.2 测序结果的生物信息学分析 | 第27-29页 |
| 2.4.5.2.1 miRNA的识别与鉴定 | 第28页 |
| 2.4.5.2.2 靶基因预测 | 第28-29页 |
| 2.4.5.2.3 椪柑愈伤组织和原生质体文库中已知和预测miRNA的差异性表达分析 | 第29页 |
| 2.4.6 poly(A)-Tailed qPCR验证miRNA的表达 | 第29-33页 |
| 2.4.6.1 总RNA提取 | 第30页 |
| 2.4.6.2 小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化 | 第30页 |
| 2.4.6.3 加尾产物纯化回收 | 第30-31页 |
| 2.4.6.4 加尾产物的反转录反应 | 第31页 |
| 2.4.6.5 模板均一化 | 第31页 |
| 2.4.6.6 PCR反应 | 第31-33页 |
| 2.4.6.7 候选miRNA的荧光定量PCR验证及表达分析 | 第33页 |
| 2.4.7 半定量RT-PCR验证miRNA靶基因 | 第33-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-64页 |
| 3.1 椪柑愈伤组织与原生质体总RNA的提取与鉴定 | 第35-37页 |
| 3.1.1 椪柑愈伤组织总RNA的提取与鉴定 | 第35页 |
| 3.1.2 四种不同方法提取椪柑原生质体总RNA的比较分析 | 第35-37页 |
| 3.1.2.1 不同方法提取的总RNA完整性检测 | 第36页 |
| 3.1.2.2 不同方法提取的总RNA纯度、浓度和产量检测 | 第36-37页 |
| 3.1.2.3 不同方法提取的总RNA的RT-PCR检验 | 第37页 |
| 3.2 椪柑愈伤组织与原生质体的小RNA测序与生物信息学分析 | 第37-61页 |
| 3.2.1 小RNA序列数据统计 | 第38页 |
| 3.2.2 小RNA长度分布统计 | 第38-39页 |
| 3.2.3 公共及特有序列统计 | 第39-40页 |
| 3.2.4 小RNA的基因组比对 | 第40页 |
| 3.2.5 小RNA首位碱基偏向性 | 第40-41页 |
| 3.2.6 小RNA的分类注释 | 第41-43页 |
| 3.2.7 miRNA的碱基编辑 | 第43-44页 |
| 3.2.8 已知miRNA的鉴定及表达分析 | 第44-46页 |
| 3.2.9 新miRNA的预测 | 第46-47页 |
| 3.2.10 miRNA差异分析结果 | 第47-52页 |
| 3.2.11 靶基因预测和功能注释 | 第52-61页 |
| 3.3 表达具显著性差异miRNA验证 | 第61-63页 |
| 3.4 半定量RT-PCR验证靶基因的表达 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-68页 |
| 4.1 改良Trizol法适用于柑橘原生质体总RNA提取 | 第64页 |
| 4.2 高通量测序是研究miRNA的有力工具 | 第64-65页 |
| 4.3 miRNA通过调控靶基因的表达起作用 | 第65-66页 |
| 4.4 miRNA在柑橘原生质体分离过程的可能作用 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-78页 |
| 附录一 | 第78-91页 |
| 附录二 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
