| 符号说明 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 1 前言 | 第18-32页 |
| 1.1 基因沉默 | 第18-19页 |
| 1.2 沉默RNA | 第19-22页 |
| 1.2.1 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) | 第19-20页 |
| 1.2.2 微小RNA(microRNA,miRNA) | 第20页 |
| 1.2.3 siRNA和miRNA的联系和区别 | 第20-21页 |
| 1.2.4 其他沉默RNA | 第21-22页 |
| 1.3 siRNA介导的RNA沉默的作用机制 | 第22-23页 |
| 1.4 RNA介导的病毒抗性 | 第23-26页 |
| 1.4.1 RNA介导的病毒抗性的特点 | 第25-26页 |
| 1.4.2 RNA介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果 | 第26页 |
| 1.5 基于siRNA的抗病毒策略 | 第26-27页 |
| 1.6 影响RNA介导的病毒抗性的因素 | 第27-29页 |
| 1.6.1 hpRNA茎结构长度的影响 | 第28页 |
| 1.6.2 hpRNA环区域的影响 | 第28-29页 |
| 1.6.3 转录速度的影响 | 第29页 |
| 1.6.4 核酸序列同源性的影响 | 第29页 |
| 1.7 多抗病毒基因工程策略 | 第29-30页 |
| 1.8 本研究的目的及其意义 | 第30-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-60页 |
| 2.1 材料 | 第32-33页 |
| 2.1.1 毒源 | 第32页 |
| 2.1.2 供试植物 | 第32页 |
| 2.1.3 菌株、质粒 | 第32页 |
| 2.1.4 酶与各种生化试剂 | 第32-33页 |
| 2.2 方法 | 第33-60页 |
| 2.2.1 靶向CMV和PVY的不同发卡结构hpRNA表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.1.1 烟草表达载体的构建策略 | 第33页 |
| 2.2.1.2 烟草表达载体的引物设计 | 第33-34页 |
| 2.2.2 靶向RBSDV或RSV的hpRNA结构的瞬时表达载体 | 第34-35页 |
| 2.2.2.1 瞬时表达载体构建策略 | 第34页 |
| 2.2.2.2 瞬时表达载体的引物设计 | 第34-35页 |
| 2.2.3 靶向RBSDV和RSV的不同发卡结构hpRNA表达载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.3.1 水稻表达载体的构建策略 | 第35-36页 |
| 2.2.3.2 水稻表达载体的引物设计 | 第36-37页 |
| 2.2.4 PCR扩增目的片段 | 第37页 |
| 2.2.5 目的片段和质粒DNA的酶切 | 第37页 |
| 2.2.6 DNA目的片段的回收(试剂盒法) | 第37-38页 |
| 2.2.7 目的片段与质粒DNA的连接 | 第38页 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| 2.2.9 质粒DNA向大肠杆菌中转化(热激法) | 第39页 |
| 2.2.10 转化菌落PCR鉴定 | 第39-40页 |
| 2.2.11 质粒DNA的大量提取(SDS法) | 第40-41页 |
| 2.2.12 重组质粒的酶切鉴定 | 第41页 |
| 2.2.13 向农杆菌转化重组质粒(冻融法) | 第41-42页 |
| 2.2.14 农杆菌介导的烟草转化 | 第42-43页 |
| 2.2.15 农杆菌介导的瞬时侵染 | 第43页 |
| 2.2.16 农杆菌介导的水稻转化 | 第43-44页 |
| 2.2.16.1 预培养 | 第43页 |
| 2.2.16.2 农杆菌侵染 | 第43-44页 |
| 2.2.16.3 转化苗筛选 | 第44页 |
| 2.2.17 植物总DNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.2.17.1 烟草总DNA的提取(CTAB法) | 第44-45页 |
| 2.2.17.2 水稻总DNA的提取(改良SDS法) | 第45页 |
| 2.2.18 转基因植株的PCR检测 | 第45页 |
| 2.2.19 T_1代转基因植株的获得 | 第45-46页 |
| 2.2.19.1 T_1代转基因烟草的获得 | 第45-46页 |
| 2.2.19.2 T_1代转基因水稻的获得 | 第46页 |
| 2.2.20 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA检测 | 第46-47页 |
| 2.2.20.1 转基因植株的抗病性鉴定 | 第46页 |
| 2.2.20.2 转基因植株的ELISA检测 | 第46-47页 |
| 2.2.21 荧光定量PCR检测植株内外源基因的表达量 | 第47-49页 |
| 2.2.21.1 转基因植株总RNA的提取(Trizol一步提取法) | 第47-48页 |
| 2.2.21.2 反转录 | 第48页 |
| 2.2.21.3 荧光定量PCR检测表达量 | 第48-49页 |
| 2.2.22 Northern杂交分析 | 第49-53页 |
| 2.2.22.1 转基因植株总RNA的提取(Trizol一步提取法) | 第49页 |
| 2.2.22.2 在甲醛凝胶上RNA电泳 | 第49页 |
| 2.2.22.3 转膜 | 第49-50页 |
| 2.2.22.4 探针制备 | 第50页 |
| 2.2.22.5 DIG标记检测有效性 | 第50-52页 |
| 2.2.22.6 杂交 | 第52-53页 |
| 2.2.23 转基因植株siRNA的提取及杂交分析 | 第53-55页 |
| 2.2.23.1 提取转基因植株的siRNA | 第53-54页 |
| 2.2.23.2 siRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 | 第54页 |
| 2.2.23.3 转膜(电转膜)siRNA及固定 | 第54-55页 |
| 2.2.23.4 siRNA探针的制备 | 第55页 |
| 2.2.23.5 siRNA杂交 | 第55页 |
| 2.2.24 Sourthern杂交分析 | 第55-60页 |
| 2.2.24.1 植物总DNA的提取 | 第55页 |
| 2.2.24.2 植物总DNA的酶切 | 第55页 |
| 2.2.24.3 总DNA凝胶电泳 | 第55-56页 |
| 2.2.24.4 转膜 | 第56页 |
| 2.2.24.5 探针制备 | 第56-57页 |
| 2.2.24.6 DIG标记有效性检测 | 第57-58页 |
| 2.2.24.7 杂交 | 第58页 |
| 2.2.24.8 洗膜与显色 | 第58-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-98页 |
| 3.1 不同嵌合基因发卡结构和功能基因差异对RNA介导的病毒抗性的影响 | 第60-78页 |
| 3.1.1 嵌合基因单发夹hpRNAi表达载体pDCPSH和pHC2bSH的构建 | 第60-64页 |
| 3.1.1.1 嵌合基因的获得 | 第60-61页 |
| 3.1.1.2 正向与反向嵌合基因片段的获得 | 第61-62页 |
| 3.1.1.3 重组植物表达载体pDCPSH和pHC2bSH的构建 | 第62-64页 |
| 3.1.2 嵌合基因双发夹hpRNAi表达载体pDCPDH和pHC2bDH的构建 | 第64-69页 |
| 3.1.2.1 重组克隆载体pBSK-hpPVYCP和pBSK-hpPVYHC的构建 | 第64-66页 |
| 3.1.2.2 重组克隆载体pT-hpCMVCP和pT-hpCMV2b的构建 | 第66-68页 |
| 3.1.2.3 重组植物表达载体pDCPDH和pHC2bDH的构建 | 第68-69页 |
| 3.1.3 转基因烟草的获得 | 第69-70页 |
| 3.1.4 转基因烟草的检测 | 第70-71页 |
| 3.1.5 转基因烟草的转录量分析 | 第71-72页 |
| 3.1.6 转基因烟草的抗病性分析 | 第72-74页 |
| 3.1.7 转基因烟草的总RNA和siRNA的Northern杂交分析 | 第74-75页 |
| 3.1.8 转基因烟草植株中Southern分析 | 第75-76页 |
| 3.1.9 T_1代转基因植株的抗病性分析 | 第76-78页 |
| 3.2 双抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒转基因水稻的培育 | 第78-98页 |
| 3.2.1 靶序列的选择 | 第78-81页 |
| 3.2.1.1 hpRNAi瞬时表达载体构建 | 第78-80页 |
| 3.2.1.2 转化农杆菌EHA105菌株 | 第80页 |
| 3.2.1.3 Northern杂交检测农杆菌介导的瞬时侵染 | 第80-81页 |
| 3.2.2 嵌合基因双发夹hpRNAi表达载体p1300DH的构建 | 第81-85页 |
| 3.2.2.1 重组克隆载体p19-hpRBSDV的构建 | 第81-84页 |
| 3.2.2.2 重组克隆载体pBSK-hpRSV的获得 | 第84-85页 |
| 3.2.2.3 重组植物表达载体p1300DH的构建 | 第85页 |
| 3.2.3 嵌合基因单发夹hpRNAi表达载体p1300SH的构建 | 第85-90页 |
| 3.2.3.1 嵌合基因的获得 | 第85-87页 |
| 3.2.3.2 正向与反向嵌合基因片段的获得 | 第87-88页 |
| 3.2.3.3 重组植物表达载体p1300SH的获得 | 第88-90页 |
| 3.2.4 转基因水稻的获得 | 第90-91页 |
| 3.2.5 转基因植株的除草剂抗性和PCR检测 | 第91-93页 |
| 3.2.6 T_1代转基因植物抗RBSDV和RSV鉴定 | 第93-95页 |
| 3.2.7 T_1代抗性株系的Southern杂交 | 第95页 |
| 3.2.8 转基因植株的总RNA和siRNA的Northern杂交分析 | 第95-96页 |
| 3.2.9 外源基因及抗性在T_2代转基因植株株系中的遗传 | 第96-98页 |
| 4 讨论 | 第98-102页 |
| 5 结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第120页 |
