| 符号说明 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 1 引言 | 第13-36页 |
| ·猪传染性胃肠炎的研究进展 | 第13-24页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统在异源蛋白表达中的应用 | 第24-29页 |
| ·花青素的药理作用研究进展 | 第29-34页 |
| ·研究的目的、意义 | 第34-36页 |
| 2 材料与方法 | 第36-56页 |
| ·材料 | 第36-42页 |
| ·药物 | 第36页 |
| ·毒株、菌株、细胞和质粒 | 第36页 |
| ·酶和试剂 | 第36-37页 |
| ·引物设计与合成 | 第37页 |
| ·试验所用溶液及其配制 | 第37-41页 |
| ·主要实验仪器设备及耗材 | 第41-42页 |
| ·花青素体外抗 TGEV 的试验研究方法 | 第42-46页 |
| ·ST cell 的复苏与培养 | 第42页 |
| ·TGEV 病毒的增殖 | 第42页 |
| ·病毒基因组 RNA 的提取 | 第42页 |
| ·RT-PCR 鉴定 | 第42-43页 |
| ·免疫过氧化物酶单层实验(IPMA) | 第43-44页 |
| ·病毒TCID_(50)的测定 | 第44-45页 |
| ·花青素对ST细胞的毒性作用-细胞形态学观察 | 第45-46页 |
| ·花青素对ST细胞上贴壁的影响 | 第45页 |
| ·花青素对ST单层细胞的影响 | 第45-46页 |
| ·花青素在ST细胞上最大安全浓度的确定 | 第46页 |
| ·花青素在ST细胞上对抗TGEV的最佳用量的确定 | 第46页 |
| ·药物的稀释 | 第46页 |
| ·TGEV 的稀释 | 第46页 |
| ·细胞的培养与病毒接种 | 第46页 |
| ·花青素在细胞上对TGEV的抑制作用 | 第46页 |
| ·猪传染性胃肠炎病毒 S 蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 及免疫原性分析的方法 | 第46-56页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增 | 第46-47页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第47页 |
| ·克隆载体TS的构建与鉴定 | 第47-49页 |
| ·目的片段与pBS-T载体的连接 | 第47-48页 |
| ·连接产物的转化 | 第48页 |
| ·质粒DNA的少量制备-碱法提取质粒 | 第48-49页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第49页 |
| ·表达载体pPIC9K-S 的构建和鉴定 | 第49-50页 |
| ·表达载体pPIC9K-S 的构建 | 第49页 |
| ·连接产物的转化 | 第49页 |
| ·表达载体pPIC9K-S 的鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组表达载体转化毕赤酵母G5115 感受态 | 第50-51页 |
| ·毕赤酵母G5115 感受态的制备 | 第50页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第50页 |
| ·线性化产物的回收 | 第50-51页 |
| ·电转化 | 第51页 |
| ·酵母阳性整合子的筛选 | 第51-52页 |
| ·利用 G418 筛选 | 第51页 |
| ·利用 PCR 筛选 | 第51-52页 |
| ·阳性整合子的诱导表达及最佳表达表达时间的确定 | 第52-53页 |
| ·S 蛋白的SDS-PAGE 检测 | 第53页 |
| ·Western-blotting 检测 | 第53页 |
| ·目的蛋白质的纯化-阴离子交换层析 | 第53-54页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测纯化后收集的组分 | 第54页 |
| ·超滤管纯化目的蛋白 | 第54-55页 |
| ·最佳超离心膜的孔径确定-微量超滤管 | 第54-55页 |
| ·15ml 超滤管大批量纯化蛋白 | 第55页 |
| ·纯化蛋白的动物免疫 | 第55页 |
| ·纯化蛋白免疫动物的抗体检测 | 第55-56页 |
| ·核酸蛋白检测 TGEV 全病毒血清 | 第55-56页 |
| ·检测鼠抗 TGEV S 蛋白抗体的间接ELISA 方法的建立 | 第56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-71页 |
| ·病毒的增殖 | 第56-57页 |
| ·RT-PCR 结果 | 第57页 |
| ·免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)结果 | 第57-58页 |
| ·TCID_(50)测定结果 | 第58-59页 |
| ·花青素对ST细胞贴壁的影响 | 第59页 |
| ·花青素对ST单层细胞的影响 | 第59-61页 |
| ·花青素在ST细胞上最大安全浓度的确定 | 第61页 |
| ·花青素在细胞上对抗TGEV的最佳用量的确定 | 第61-62页 |
| ·花青素在ST细胞上对TGEV的抑制作用 | 第62页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第62-63页 |
| ·克隆载体 TS 的鉴定 | 第63-64页 |
| ·蓝白斑筛选 | 第63页 |
| ·PCR 和酶切鉴定 | 第63-64页 |
| ·表达载体pPIC9K-S 的鉴定 | 第64页 |
| ·质粒pPIC9K-S 的线性化 | 第64-65页 |
| ·酵母基因组PCR 鉴定 | 第65页 |
| ·最佳诱导表达时间的确定 | 第65-66页 |
| ·S 蛋白的SDS-PAGE 检测 | 第66页 |
| ·S 蛋白的Western-blotting 检测 | 第66-67页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第67-69页 |
| ·阴离子交换层析纯化曲线图 | 第67页 |
| ·收集管中样品的 SDS-PAGE 电泳结果 | 第67-68页 |
| ·微量超滤管纯化结果 | 第68-69页 |
| ·纯化蛋白免疫动物的抗体检测 | 第69-71页 |
| ·核酸蛋白检测 TGEV 全病毒血清 | 第69页 |
| ·检测鼠抗TGEV S 蛋白抗体的间接ELISA 方法的建立-最适抗原包被浓度的确定 | 第69-71页 |
| ·鼠抗 TGEV S 蛋白抗体效价的检测 | 第71页 |
| 4 讨论 | 第71-77页 |
| ·花青素 | 第71-72页 |
| ·免疫过氧化物酶试验 | 第72-74页 |
| ·pGEX-N 原核表达核酸蛋白的制备 | 第74页 |
| ·PET-S 原核表达蛋白的制备 | 第74页 |
| ·关于毕赤酵母表达 | 第74-77页 |
| 5 结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第90页 |
