| 符号说明 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-20页 |
| 1.1 酚氧化酶研究概况 | 第12-18页 |
| 1.1.1 酚氧化酶的起源 | 第12-13页 |
| 1.1.2 酚氧化酶的生化特性 | 第13-14页 |
| 1.1.3 酚氧化酶的分子生物学研究 | 第14-15页 |
| 1.1.4 酚氧化酶基因的调控概述 | 第15页 |
| 1.1.5 酚氧化酶的功能 | 第15-17页 |
| 1.1.6 酚氧化酶重组蛋白的体外表达 | 第17-18页 |
| 1.2 选题目的和意义 | 第18-19页 |
| 1.3 本研究的技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-40页 |
| 2.1 试虫饲养 | 第20页 |
| 2.2 试剂及仪器设备 | 第20-23页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.2 试剂配制 | 第21-23页 |
| 2.2.3 仪器设备 | 第23页 |
| 2.3 小菜蛾总RNA的提取、鉴定及cDNA合成 | 第23-26页 |
| 2.3.1 小菜蛾总RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.3.2 小菜蛾总RNA的检测 | 第24-25页 |
| 2.3.3 小菜蛾第一链cDNA合成 | 第25-26页 |
| 2.4 PxPPO1编码蛋白序列全长的克隆 | 第26-30页 |
| 2.4.1 引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.4.2 PCR反应 | 第27-28页 |
| 2.4.3 PCR产物的纯化 | 第28-29页 |
| 2.4.4 转化大肠杆菌和克隆测序 | 第29-30页 |
| 2.5 PxPPO2编码蛋白序列全长的克隆 | 第30-31页 |
| 2.5.1 引物的设计 | 第30-31页 |
| 2.5.2 PCR扩增、转化大肠杆菌及克隆测序 | 第31页 |
| 2.6 PxPPO1原核表达载体的构建 | 第31-34页 |
| 2.6.1 pET-30a菌种的培养 | 第31页 |
| 2.6.2 试剂盒抽提质粒DNA | 第31-32页 |
| 2.6.3 酶切反应 | 第32页 |
| 2.6.4 连接反应 | 第32-33页 |
| 2.6.5 E.coli BL21感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.6.6 重组DNA的转化 | 第33-34页 |
| 2.6.7 重组体的筛选 | 第34页 |
| 2.7 PxPP02原核表达载体的构建 | 第34页 |
| 2.8 目标蛋白在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达 | 第34-36页 |
| 2.8.1 常规培养诱导表达产物 | 第34-35页 |
| 2.8.2 最适IPTG浓度的选择 | 第35页 |
| 2.8.3 最适诱导温度的选择 | 第35-36页 |
| 2.8.4 最适诱导时间的选择 | 第36页 |
| 2.8.5 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第36页 |
| 2.9 表达蛋白的溶解性验证 | 第36-37页 |
| 2.9.1 目标蛋白的大量诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.9.2 超声波破碎表达蛋白 | 第37页 |
| 2.10 Western印迹鉴定表达产物 | 第37-38页 |
| 2.10.1 转膜 | 第37页 |
| 2.10.2 免疫反应 | 第37-38页 |
| 2.11 球孢白僵菌处理后菜青虫PrPPO1的表达研究 | 第38-39页 |
| 2.11.1 供试昆虫与菌株 | 第38页 |
| 2.11.2 实时荧光定量PCR(Real-time-PCR) | 第38-39页 |
| 2.12 菜青虫血细胞中类绛色细胞密度 | 第39-40页 |
| 2.12.1 血细胞的收集 | 第39页 |
| 2.12.2 类绛色细胞密度测定 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-51页 |
| 3.1 PxPPO1和PxPPO2编码区序列的扩增 | 第40页 |
| 3.2 重组子pEASY-T3-PxPPO的PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3 原核表达质粒的构建 | 第41页 |
| 3.4 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第41-43页 |
| 3.5 PxPPO在E.coli BL21(DE3)中的表达 | 第43-47页 |
| 3.5.1 常规条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第43-44页 |
| 3.5.2 不同IPTG浓度下诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第44页 |
| 3.5.3 不同诱导时间诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第44-45页 |
| 3.5.4 不同诱导温度诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第45页 |
| 3.5.5 融合蛋白的表达形式分析 | 第45-47页 |
| 3.6 Western印迹鉴定 | 第47-48页 |
| 3.7 白僵菌侵染对菜青虫PrPPO1表达的影响 | 第48-49页 |
| 3.8 菜青虫PrPPO1的表达量与类绛色细胞密度的关系 | 第49-51页 |
| 4 讨论 | 第51-56页 |
| 4.1 基因编码区PCR扩增 | 第51页 |
| 4.2 酶切和连接 | 第51页 |
| 4.3 诱导表达 | 第51-52页 |
| 4.4 优化表达条件 | 第52-53页 |
| 4.5 表达产物的western印迹鉴定 | 第53页 |
| 4.6 白僵菌孢子侵染后菜青虫PrPPO1的表达情况 | 第53-54页 |
| 4.7 菜青虫PrPPO1的表达及类绛色细胞密度 | 第54页 |
| 4.8 以PO为“靶标”设计环境友好农药的思考 | 第54-56页 |
| 5 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第66页 |
