| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 前言 | 第10-16页 |
| 1 肺动脉高压预后差,治疗难 | 第10页 |
| 2 肺动脉平滑肌细胞增殖与肺动脉高压 | 第10-11页 |
| 2.1 血管平滑肌增殖是血管重塑的重要细胞学基础 | 第10-11页 |
| 2.2 肺血管重塑与肺动脉高压的发生、发展密切相关 | 第11页 |
| 3 血管平滑肌细胞周期及其调控 | 第11-13页 |
| 3.1 血管平滑肌细胞的增殖周期 | 第11-12页 |
| 3.2 细胞周期调控 | 第12-13页 |
| 4 K~+通道蛋白与肺动脉平滑肌增殖以及PAH的关系 | 第13-14页 |
| 5 SIRT1在肺动脉平滑肌增殖,肺动脉高压发生、发展中可能发挥的作用 | 第14-15页 |
| 6 SIRT1是否能抑制肺动脉平滑肌增殖并延缓肺动脉高压的发生、发展是本研究的重点 | 第15-16页 |
| 实验材料 | 第16-18页 |
| 1 病毒 | 第16页 |
| 2 细胞 | 第16页 |
| 3 实验用大鼠及饲料 | 第16页 |
| 4 酶类 | 第16页 |
| 5 其他主要试剂 | 第16页 |
| 6 实验用抗体 | 第16-17页 |
| 7 主要仪器设备 | 第17-18页 |
| 实验方法 | 第18-30页 |
| 1 人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)培养与腺病毒感染 | 第18-19页 |
| 1.1 人肺动脉平滑肌细胞传代培养 | 第18页 |
| 1.2 人肺动脉平滑肌细胞的冻存 | 第18页 |
| 1.3 人肺动脉平滑肌细胞的复苏 | 第18页 |
| 1.4 人肺动脉平滑肌细胞的腺病毒感染 | 第18-19页 |
| 1.5 人肺动脉平滑肌细胞同步化处理 | 第19页 |
| 2 重组腺病毒的制备 | 第19-21页 |
| 2.1 建立备用病毒 | 第19页 |
| 2.2 重组腺病毒的生产 | 第19-20页 |
| 2.3 病毒纯化 | 第20页 |
| 2.4 重组腺病毒质量检测 | 第20-21页 |
| 3 RT-PCR | 第21-22页 |
| 3.1 RNA提取 | 第21页 |
| 3.2 逆转录PCR(RT-PCR) | 第21页 |
| 3.3 Realtime PCR | 第21-22页 |
| 4 Western blot | 第22-24页 |
| 4.1 细胞蛋白提取 | 第22页 |
| 4.2 蛋白质浓度测定 | 第22-23页 |
| 4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第23页 |
| 4.4 抗原抗体反应 | 第23页 |
| 4.5 辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第23-24页 |
| 4.6 溶液配制 | 第24页 |
| 5 流式细胞仪检测细胞周期 | 第24页 |
| 6 肺动脉高压大鼠模型的建立 | 第24-25页 |
| 6.1 试剂的准备 | 第24-25页 |
| 6.2 模型的建立 | 第25页 |
| 7 大鼠血流动力学的检测 | 第25-26页 |
| 8 组织器官的采集和保存 | 第26页 |
| 9 组织蛋白提取 | 第26页 |
| 10 组织切片、HE染色和免疫组化 | 第26-29页 |
| 10.1 组织切片 | 第26-27页 |
| 10.2 HE染色及形态学分析 | 第27页 |
| 10.3 免疫组化(二步法) | 第27-28页 |
| 10.4 EVG染色 | 第28页 |
| 10.5 TUNEL染色 | 第28-29页 |
| 11 统计学方法 | 第29-30页 |
| 实验结果 | 第30-51页 |
| 1 血小板源生长因子诱导人肺动脉平滑肌细胞内源性SIRT1的表达动态改变 | 第30-31页 |
| 2 SIRT1促进人肺动脉平滑肌细胞增殖周期的阻滞 | 第31-34页 |
| 2.1 过表达SIRT1引起HPASMCs G0/G1期阻滞 | 第31页 |
| 2.2 SIRT1影响了HPASMCs中G1期相关周期蛋白的表达 | 第31-34页 |
| 2.2.1 过表达SIRT1下调HPASMCs中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达,上调p21的表达 | 第31-33页 |
| 2.2.2 SIRT1 RNA1上调HPASMCs中CyclinDl,CyclinE,CDK2的表达,下调p21的表达 | 第33-34页 |
| 3 SIRT1抑制了PDGF-BB对HPASMCs中Kv通道Kv1.5和Kv2.1的下调 | 第34-36页 |
| 4 Resveratrol下调HPASMCs中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达,上调p21,Kv1.5和Kv2.1的表达 | 第36-39页 |
| 5 SIRT1的激活剂resveratrol能增加MCT诱导的PAH大鼠肺组织SIRT1、p21、Kv1.5和Kv2.1的表达,抑制PAH的发展 | 第39-51页 |
| 5.1 野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中,肺组织中SIRT1的表达水平明显降低 | 第39-40页 |
| 5.2 Resveratrol改善了PAH大鼠肺血流动力学 | 第40-42页 |
| 5.3 Resveratrol抑制肺动脉的重塑 | 第42-48页 |
| 5.3.1 Resveratrol抑制肺肌性动脉中膜增厚 | 第42-44页 |
| 5.3.2 Resveratrol抑制肺非肌性小动脉的肌化 | 第44-46页 |
| 5.3.3 Resveratrol未引起肺小动脉中凋亡细胞数量的显著改变 | 第46-48页 |
| 5.4 Resveratrol明显增加了模型鼠肺组织中SIRT1,Kv1.5和Kv2.1,p21的表达 | 第48-51页 |
| 讨论 | 第51-57页 |
| 1 选择HPASMCs作为研究对象的原因：作用关键,机制不清,提供新治疗靶点 | 第51页 |
| 2 SIRT1抑制HPASMCs增殖,进而改善肺血管重塑的可能性 | 第51-54页 |
| 2.1 SIRT1抑制HPASMCs增殖 | 第51-52页 |
| 2.2 Resveratrol抑制HPASMCs增殖,改善MCT诱导的PAH肺血管重塑的作用与SIRT的相关性 | 第52-53页 |
| 2.3 本实验中,resveratrol的剂量与其效应之间的关系 | 第53-54页 |
| 3 SIRT1抑制HPASMCs增殖的机制 | 第54-55页 |
| 3.1 SIRT1抑制细胞周期蛋白 | 第54页 |
| 3.2 SIRT1从转录水平增加K~+通道的表达 | 第54-55页 |
| 4 本研究的不足与展望 | 第55-57页 |
| 小结 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 文献综述 | 第64-73页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
| 英文名词及缩写 | 第73-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
