| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 第一章 绪论 | 第14-30页 |
| 1.1 植物愈伤组织培养 | 第14-15页 |
| 1.1.1 植物内源和外源激素对愈伤组织培养的作用 | 第14页 |
| 1.1.2 多胺对植物愈伤组织生长状态的影响 | 第14-15页 |
| 1.1.3 植物细胞内源多胺的检测方法 | 第15页 |
| 1.2 植物细胞质雄性不育 | 第15-22页 |
| 1.2.1 植物细胞质雄性不育的特征及类型 | 第15-16页 |
| 1.2.2 植物CMS 及其育性恢复的分子机理 | 第16-20页 |
| 1.2.3 HL-CMS 水稻相关不育基因及恢复基因的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.3 RNAi 技术在植物基因功能研究中的应用 | 第22-26页 |
| 1.4 糖基转移酶 | 第26-27页 |
| 1.4.1 烟草糖基转移酶基因sm-Ngt1 的功能研究 | 第26-27页 |
| 1.5 本研究的主要内容 | 第27-28页 |
| 1.5.1 一种新的水稻愈伤组织培养基改进配方的研究 | 第27页 |
| 1.5.2 载体的构建和遗传转化 | 第27页 |
| 1.5.3 转基因植株的分子及表型鉴定 | 第27-28页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第28-30页 |
| 第二章 籼稻粤泰B 愈伤组织内源多胺含量的变化及多胺合成关键酶基因adc 和 samdc 的表达分析 | 第30-54页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 试验材料、试剂及仪器 | 第30-32页 |
| 2.2.1 试验材料 | 第30页 |
| 2.2.2 主要试剂及水稻愈伤组织培养基 | 第30-31页 |
| 2.2.2.1 化学试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.2.2 籼稻YTB 诱导及继代的基本培养基 | 第31页 |
| 2.2.3 用于RT-PCR 的基因特异性引物 | 第31-32页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.3.1 水稻愈伤组织的诱导及继代 | 第32-33页 |
| 2.3.2 内源多胺的提取和含量测定 | 第33页 |
| 2.3.3 精氨酸脱羧酶基因(adc)及S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(samdc)定量表达分析 | 第33-35页 |
| 2.3.3.1 总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成 | 第33-34页 |
| 2.3.3.2 实时荧光定量PCR 检测 | 第34-35页 |
| 2.3.4 籼稻YTB 愈伤组织内部胚性细胞的切片观察 | 第35页 |
| 2.4 结果与分析 | 第35-43页 |
| 2.4.1 标准曲线绘制 | 第35-36页 |
| 2.4.2 愈伤组织内源多胺的色谱图 | 第36-37页 |
| 2.4.3 YTB 成熟胚愈伤组织继代培养不同时期内源多胺含量的测定 | 第37-39页 |
| 2.4.4 YTB 愈伤组织继代培养不同时期内源Put 含量的变化 | 第39-41页 |
| 2.4.5 YTB 愈伤组织继代培养不同时期内源Spd 含量的变化 | 第41-42页 |
| 2.4.6 YTB 愈伤组织继代培养不同时期内源Spm 含量的变化 | 第42页 |
| 2.4.7 YTB 愈伤组织继代培养不同时期内源多胺总量的变化 | 第42-43页 |
| 2.5 外源Put 处理对adc 及samdc 基因表达的影响 | 第43-47页 |
| 2.6 外源Put 对愈伤组织生长状态及胚性的影响 | 第47-50页 |
| 2.7 讨论 | 第50-54页 |
| 第三章 GTPB/GTPC∷RF185’∷orf216 表达载体的遗传转化及鉴定 | 第54-74页 |
| 3.1 引言 | 第54-56页 |
| 3.2 实验材料、试剂及仪器 | 第56-66页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第57-58页 |
| 3.2.2.1 生化试剂 | 第57页 |
| 3.2.2.2 水稻愈伤组织培养基 | 第57-58页 |
| 3.2.2.3 LB 培养基配制 | 第58页 |
| 3.2.2.4 用于载体构建的相关菌种 | 第58页 |
| 3.2.3 PCR 检测引物 | 第58页 |
| 3.2.4 实验设备 | 第58-59页 |
| 3.2.5 实验方法 | 第59-63页 |
| 3.2.5.1 碱裂解法小量提取质粒DNA | 第59页 |
| 3.2.5.2 质粒DNA 双酶切 | 第59-60页 |
| 3.2.5.3 酶切产物的回收与纯化 | 第60-61页 |
| 3.2.5.4 感受态细胞的制备 | 第61-62页 |
| 3.2.5.5 目的片段与载体质粒DNA 片段的连接与电激转化 | 第62-63页 |
| 3.2.5.6 新构建载体转化菌种的阳性检测 | 第63页 |
| 3.2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第63-65页 |
| 3.2.6.1 水稻愈伤组织的诱导及继代 | 第63-64页 |
| 3.2.6.2 农杆菌的活化及悬浮培养 | 第64页 |
| 3.2.6.3 愈伤组织的浸染及共培养 | 第64页 |
| 3.2.6.4 抗性愈伤组织的筛选与分化 | 第64页 |
| 3.2.6.5 幼苗生根、壮苗及移栽 | 第64-65页 |
| 3.2.7 转基因水稻植株的分子检测 | 第65-66页 |
| 3.2.7.1 转基因水稻植株基因组DNA 的小量提取 | 第65页 |
| 3.2.7.2 转基因植株基因组DNA 的PCR 分析 | 第65-66页 |
| 3.2.8 转基因水稻植株的表型鉴定 | 第66页 |
| 3.2.8.1 转基因植株的花粉育性鉴定 | 第66页 |
| 3.2.8.2 转基因植株结实率统计 | 第66页 |
| 3.3 结果与分析 | 第66-72页 |
| 3.3.1 GTpB/GTpC∷Rf165’∷orf216 表达载体的构建及检测 | 第66-68页 |
| 3.3.2 GTpB/GTpC∷Rf165’∷orf216 转基因植株的鉴定及表型分析 | 第68-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 CaMV355∷RF185’∷mxI 超表达载体的遗传转化及鉴定 | 第74-85页 |
| 4.1 引言 | 第74-75页 |
| 4.2 实验材料、试剂及仪器 | 第75-78页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第75-76页 |
| 4.2.2 实验试剂 | 第76页 |
| 4.2.2.1 生化试剂 | 第76页 |
| 4.2.2.2 水稻愈伤组织培养基 | 第76页 |
| 4.2.2.3 载体构建及其遗传转化植株检测的相关PCR 引物 | 第76页 |
| 4.2.3 实验设备 | 第76页 |
| 4.2.4 实验方法 | 第76-78页 |
| 4.2.4.1 碱裂解法小量提取质粒DNA | 第76页 |
| 4.2.4.2 Trizol 法提取HL-CMS 保持系YTB 的总RNA 并反转录合成cDNA第一链 | 第76页 |
| 4.2.4.3 mxI 目的基因片段的扩增及回收纯化 | 第76-77页 |
| 4.2.4.4 mxI 基因PCR 产物及pXH216 载体的双酶切及目的片段的回收和纯化 | 第77-78页 |
| 4.2.4.5 目的片段与载体质粒DNA 片段的连接与电激转化 | 第78页 |
| 4.2.4.6 感受态细胞的制备 | 第78页 |
| 4.2.5 农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第78页 |
| 4.2.6 转基因水稻植株的分子检测 | 第78页 |
| 4.2.6.1 CTAB 法小量提取YTA 转基因水稻植株基因组DNA | 第78页 |
| 4.2.6.2 转基因植株基因组DNA 的PCR 分析 | 第78页 |
| 4.2.7 转基因水稻植株的表型鉴定 | 第78页 |
| 4.3 结果与分析 | 第78-82页 |
| 4.3.1 CaMV355∷Rf165’∷mxI 表达载体的构建及检测 | 第78-82页 |
| 4.4 讨论 | 第82-85页 |
| 第五章 orf216 基因和sm-Ngt1 基因的RNAi 载体构建及遗传转化 | 第85-99页 |
| 5.1 引言 | 第85页 |
| 5.2 实验材料、试剂及仪器 | 第85-91页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第85-86页 |
| 5.2.2 实验试剂 | 第86-87页 |
| 5.2.2.1 生化试剂 | 第86页 |
| 5.2.2.2 烟草叶盘外植体转化用培养基 | 第86页 |
| 5.2.2.3 载体构建及检测的相关 PCR 引物 | 第86-87页 |
| 5.2.3 实验设备 | 第87页 |
| 5.2.4 实验方法 | 第87-90页 |
| 5.2.4.1 碱裂解法小量提取质粒DNA | 第87页 |
| 5.2.4.2 Trizol 法提取烟草W38 的总RNA 并反转录合成cDNA 第一链 | 第87页 |
| 5.2.4.3 目的基因片段的扩增及回收纯化 | 第87页 |
| 5.2.4.4 感受态细胞的制备 | 第87页 |
| 5.2.4.5 BP 反应构建入门克隆载体 | 第87-88页 |
| 5.2.4.6 BP 反应混合物转化感受态细胞 | 第88页 |
| 5.2.4.7 PCR 检测BP 反应阳性克隆并测序 | 第88-89页 |
| 5.2.4.8 入门克隆菌液提取质粒DNA | 第89页 |
| 5.2.4.9 LR 反应构建RNAi 表达载体 | 第89-90页 |
| 5.2.4.10 LR 反应混合物转化感受态细胞 | 第90页 |
| 5.2.4.11 PCR 检测LR 反应阳性克隆 | 第90页 |
| 5.2.5 农杆菌介导的烟草W38 遗传转化 | 第90-91页 |
| 5.3 结果与分析 | 第91-96页 |
| 5.3.1 应用Gateway 技术构建RNAi 载体流程 | 第91-92页 |
| 5.3.2 BP 反应构建入门克隆载体 | 第92-93页 |
| 5.3.3 LR 反应构建RNAi 表达载体 | 第93-95页 |
| 5.3.4 sm-Ngt1-RNAi 载体的遗传转化 | 第95-96页 |
| 5.4 讨论 | 第96-99页 |
| 参考文献 | 第99-115页 |
| 附录一：常用激素及抗生素的配制 | 第115-116页 |
| 附录二：相关试剂及培养基的配制 | 第116-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 在读期间发表的论文 | 第118页 |
| 在读期间参与的科研课题及学术活动 | 第118页 |
