| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第11-19页 |
| 1.1 林可霉素研究概况 | 第11-12页 |
| 1.2 林可霉素的结构 | 第12-13页 |
| 1.3 林可霉素生物合成基因簇 | 第13-17页 |
| 1.3.1 三个抗性基因lmrA、lmrB和lmrC | 第14-15页 |
| 1.3.2 三个推定的调控基因lmbIH、lmbQ和lmbU | 第15页 |
| 1.3.3 三个推定的甲基化酶基因lmbG、lmbJ和lmbW | 第15页 |
| 1.3.4 lmbA、lmbB1、lmbB2、lmbC、lmbF、lmbK、lmbX、lmbY和lmbZ基因 | 第15页 |
| 1.3.5 从lmbL到lmbT的糖合成相关基因 | 第15-16页 |
| 1.3.6 林可霉素生物合成基因可能的功能列表(表1.2) | 第16-17页 |
| 1.4 林可霉素的生物合成途径 | 第17-18页 |
| 1.5 研究的主要内容和意义 | 第18-19页 |
| 第2章 材料与方法 | 第19-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-24页 |
| 2.1.1 质粒 | 第19-20页 |
| 2.1.2 菌株 | 第20-21页 |
| 2.1.3 引物 | 第21-22页 |
| 2.1.4 仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.5 试剂 | 第23页 |
| 2.1.6 培养基 | 第23页 |
| 2.1.7 溶液 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 DNA电泳及DNA片段的回收和纯化 | 第24页 |
| 2.2.1.1 DNA电泳 | 第24页 |
| 2.2.1.2 琼脂糖凝胶中回收DNA并纯化(DNA片段不大于5 kb) | 第24页 |
| 2.2.2 DNA的酶切和连接 | 第24页 |
| 2.2.2.1 DNA限制性内切酶的使用 | 第24页 |
| 2.2.2.2 DNA的连接 | 第24页 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.3.1 大肠杆菌质粒DNA的碱法小量制备 | 第24-25页 |
| 2.2.3.2 试剂盒(上海生工)提取大肠杆菌质粒DNA | 第25页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第25页 |
| 2.2.4.1 钙法普通感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 2.2.4.2 感受态细胞的转化 | 第25页 |
| 2.2.5 PCR及PCR产物的克隆 | 第25-26页 |
| 2.2.5.1 PCR | 第25-26页 |
| 2.2.5.2 PCR产物的克隆 | 第26页 |
| 2.2.6 S.lincolnensis和E.coli的属间接合转移 | 第26-27页 |
| 2.2.6.1 E.coli供体菌的制备 | 第26页 |
| 2.2.6.2 S.lincolnens受体菌的制备 | 第26-27页 |
| 2.2.6.3 接合转移 | 第27页 |
| 2.2.7 S.lincolnens发酵,以及高效液相色谱(HPLC)、液质联用(LC-MS)方法检测 | 第27页 |
| 2.2.7.1 发酵 | 第27页 |
| 2.2.7.2 发酵产物的HPLC及LC-MS检测条件 | 第27页 |
| 2.2.8 S.lincolnens基因组文库的构建 | 第27-30页 |
| 2.2.8.1 收集菌丝 | 第27页 |
| 2.2.8.2 抽提基因组DNA | 第27页 |
| 2.2.8.3 EPI300—T1~R菌种的复苏 | 第27-28页 |
| 2.2.8.4 插入片段的制备 | 第28页 |
| 2.2.8.5 蔗糖梯度离心分离纯化DNA片段 | 第28页 |
| 2.2.8.6 插入片段末端补平、分离及回收 | 第28页 |
| 2.2.8.7 将DNA片段连至载体 | 第28-29页 |
| 2.2.8.8 包装 | 第29页 |
| 2.2.8.9 转染与保存 | 第29-30页 |
| 第3章 S.lincolnensis接合转移系统的建立和优化 | 第30-34页 |
| 3.1 载体的选取 | 第30页 |
| 3.2 供体细菌的选取 | 第30-31页 |
| 3.3 接合转移培养基的选取 | 第31页 |
| 3.4 大肠杆菌-林可链霉菌属间接合转移结果 | 第31-32页 |
| 3.5 接合转移转化子的的检测 | 第32-33页 |
| 3.6 小结 | 第33-34页 |
| 第4章 S.lincolnensis基因组文库的构建及林可霉素生物合成基因簇筛选 | 第34-42页 |
| 4.1 S.lincolnensis基因组文库的构建 | 第35-37页 |
| 4.1.1 S.lincolnensis总DNA的提取 | 第35页 |
| 4.1.2 S.lincolnensis gDNA的机械打断 | 第35页 |
| 4.1.3 蔗糖密度梯度离心 | 第35-36页 |
| 4.1.4 总DNA片断末端补平并与载体连接 | 第36-37页 |
| 4.1.5 包装转染和文库扩增 | 第37页 |
| 4.2 林可霉素生物合成基因簇的筛选 | 第37-41页 |
| 4.2.1 第一轮PCR | 第38页 |
| 4.2.2 第二轮PCR | 第38-39页 |
| 4.2.3 第三轮PCR | 第39-41页 |
| 4.2.4 CosmidlE8亚克隆测序 | 第41页 |
| 4.3 小结 | 第41-42页 |
| 第5章 林可霉素生物合成基因簇中三个推定的调控基因lmbIH、lmbQ和lmbU的功能研究 | 第42-50页 |
| 5.1 lmbU基因的同框敲除及突变株发酵 | 第42-45页 |
| 5.1.1 中断载体pWZL-URL的构建 | 第42-43页 |
| 5.1.2 同框敲除突变株mWZL-DU的筛选及发酵 | 第43-45页 |
| 5.2 lmbQ基因的同框敲除及突变株发酵 | 第45-48页 |
| 5.2.1 中断载体pWZL-QRL的构建 | 第45-46页 |
| 5.2.2 同框敲除突变株mWZL-DQ的筛选及发酵 | 第46-48页 |
| 5.3 lmbIH因的同框敲除及突变株发酵 | 第48-49页 |
| 5.3.1 中断载体pWZL-IHRL的构建 | 第48页 |
| 5.3.2 同框敲除突变株mWZL-DIH的筛选及发酵 | 第48-49页 |
| 5.4 小结 | 第49-50页 |
| 第6章 林可霉素生物合成基因簇中三个推定的甲基化酶基因lmbbM1、lmbM2和lmbM3的功能研究 | 第50-60页 |
| 6.1 lmbM1基因的功能研究 | 第50-55页 |
| 6.1.1 中断载体pWZL-M1RL的构建 | 第50-51页 |
| 6.1.2 同框敲除突变株mWZL-DM1的筛选及发酵 | 第51-52页 |
| 6.1.3 同框敲除突变株mWZL-DM1发酵中间产物的分离和鉴定 | 第52-55页 |
| 6.2 lmbM2基因功能研究 | 第55-56页 |
| 6.2.1 中断载体pWZL-M2RL的构建 | 第55页 |
| 6.2.2 同框敲除突变株mWZL-DM2的筛选及发酵 | 第55-56页 |
| 6.3 lmbM3基因功能研究 | 第56-59页 |
| 6.3.1 中断载体pWZL-M3RL的构建 | 第56-57页 |
| 6.3.2 mWZL-DM3的筛选及发酵 | 第57-58页 |
| 6.3.3 突变株mWZL-M3RL发酵积累产物的分离和鉴定 | 第58-59页 |
| 6.4 小结 | 第59-60页 |
| 总结与展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附录Ⅰ | 第66-67页 |
| 附录Ⅱ | 第67-68页 |
| 附录Ⅲ | 第68-69页 |
| 附录Ⅳ | 第69-70页 |
