| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第15-27页 |
| 第一章 猪圆环病毒2型致病机制研究进展 | 第15-27页 |
| 1.1 PCV2 病原学 | 第15-19页 |
| 1.1.1 圆环病毒概述 | 第15-18页 |
| 1.1.2 PCV2 的分离方法 | 第18页 |
| 1.1.3 病毒的复制 | 第18-19页 |
| 1.2 PCV2 致病机制 | 第19-24页 |
| 1.2.1 PCV2 的细胞噬性与进入细胞的方式 | 第19-21页 |
| 1.2.2 PCV2 对外周血单核细胞的影响 | 第21页 |
| 1.2.3 PCV2 对树突状细胞的影响 | 第21-22页 |
| 1.2.4 PCV2 对肺泡巨噬细胞的影响 | 第22页 |
| 1.2.5 PCV2 对发病猪细胞因子分泌的影响 | 第22-24页 |
| 1.3 PCV2 和宿主蛋白的相互作用 | 第24-26页 |
| 1.3.1 PCV2 结构蛋白和非结构蛋白与宿主蛋白的相互作用 | 第24页 |
| 1.3.2 PCV2 DNA 与宿主蛋白的相互作用 | 第24-26页 |
| 1.4 本研究目的和意义 | 第26-27页 |
| 试验研究 | 第27-88页 |
| 第二章 猪圆环病毒2型感染性克隆的构建及鉴定 | 第27-36页 |
| 2.1 材料 | 第27-28页 |
| 2.1.1 组织病料采集及处理 | 第27页 |
| 2.1.2 载体、菌株及细胞株 | 第27页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第27页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 方法 | 第28-30页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第28页 |
| 2.2.2 组织病料DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.3 PCV2 阳性病料鉴定 | 第28页 |
| 2.2.4 PCV2 全基因组扩增及克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.5 PCV2 全基因组环化并转染PK-15细胞 | 第29-30页 |
| 2.2.6 PCV2 的增殖 | 第30页 |
| 2.2.7 PCV2 的鉴定 | 第30页 |
| 2.3 结果 | 第30-34页 |
| 2.3.1 PCV2 阳性病料的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.2 PCV2 全基因组的扩增及克隆 | 第31-32页 |
| 2.3.3 序列分析 | 第32-33页 |
| 2.3.4 PCV2 的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.4 讨论 | 第34-35页 |
| 2.5 小结 | 第35-36页 |
| 第三章 猪圆环病毒2型Rep、Cap和 ORF3 蛋白多克隆抗体的制备 | 第36-45页 |
| 3.1 材料 | 第36-37页 |
| 3.1.1 载体、菌株及试验动物 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第36页 |
| 3.1.4 溶液配制 | 第36-37页 |
| 3.2 方法 | 第37-39页 |
| 3.2.1 PCR 扩增 PCV2 ORF1、ORF2 和ORF3 编码基因 | 第37页 |
| 3.2.2 原核表达载体 pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3 的构建 | 第37-38页 |
| 3.2.3 动物免疫试验 | 第38-39页 |
| 3.2.4 多克隆抗体的纯化及滴度和特异性鉴定 | 第39页 |
| 3.3 结果 | 第39-43页 |
| 3.3.1 重组 pET-ORF1、pET-ORF2 和 pET-ORF3 原核表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 3.3.2 PCV2 Rep、Cap 和 ORF3 重组蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析 | 第40-42页 |
| 3.3.3 PCV2 Rep、Cap 和 ORF3 多克隆抗体的纯化及效价鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-44页 |
| 3.5 小结 | 第44-45页 |
| 第四章 猪圆环病毒2型 Rep、Cap 和 ORF3 蛋白腺病毒表达系统的构建及鉴定 | 第45-54页 |
| 4.1 材料 | 第45页 |
| 4.1.1 毒株及细胞株 | 第45页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第45页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第45页 |
| 4.2 方法 | 第45-48页 |
| 4.2.1 ORF1、ORF2 和 ORF3 基因的 PCR 扩增 | 第45-46页 |
| 4.2.2 重组穿梭质粒 pShuttle-ORF1、pShuttle-ORF2 和 pShuttle-ORF3 构建与鉴定 | 第46页 |
| 4.2.3 重组质粒 p Ad-CMV-ORF1、pAd-CMV-ORF2、pAd-CMV-ORF3 和 pAd-CMV 的构建与鉴定 | 第46-47页 |
| 4.2.4 转染 | 第47页 |
| 4.2.5 重组腺病毒的传代与鉴定 | 第47-48页 |
| 4.3 结果 | 第48-52页 |
| 4.3.1 PCV2 ORF1、ORF2 和 ORF3 的 PCR 扩增 | 第48页 |
| 4.3.2 重组穿梭质粒 pShuttle-ORF1、pShuttle-ORF2 和 pShuttle-ORF3 的鉴定 | 第48-49页 |
| 4.3.3 重组质粒 p Ad-CMV-ORF1、pAd-CMV-ORF2 和 pAd-CMV-ORF3 的鉴定 | 第49-50页 |
| 4.3.4 重组腺病毒的鉴定 | 第50-52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 4.5 小结 | 第53-54页 |
| 第五章 猪圆环病毒2型对猪肺泡巨噬细胞 IL-10 表达的影响及调控机制 | 第54-77页 |
| 5.1 材料 | 第54-56页 |
| 5.1.1 毒株及细胞株 | 第54页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第54-55页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第55页 |
| 5.1.4 试剂配制 | 第55-56页 |
| 5.2 方法 | 第56-61页 |
| 5.2.1 细胞分离、培养及病毒增殖 | 第56页 |
| 5.2.2 酶联免疫检测（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） | 第56页 |
| 5.2.3 荧光定量 PCR | 第56-57页 |
| 5.2.4 双荧光素报告基因检测 | 第57页 |
| 5.2.5 相关信号途径的抑制 | 第57-58页 |
| 5.2.6 western blotting 检测 | 第58-59页 |
| 5.2.7 染色质免疫共沉淀（ChIP） | 第59-60页 |
| 5.2.8 免疫共沉淀（Co-IP） | 第60页 |
| 5.2.9 gC1qR 敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建 | 第60-61页 |
| 5.2.10 数据分析 | 第61页 |
| 5.3 结果 | 第61-73页 |
| 5.3.1 PCV2 感染猪肺泡巨噬细胞中 IL-10 的动力学变化 | 第61-62页 |
| 5.3.2 PCV2 感染猪肺泡巨噬细胞中相关信号途径的激活 | 第62-64页 |
| 5.3.3 PCV2 感染猪肺泡巨噬细胞早期通过 PI3K/Akt 辅助 NF-κB 信号途径调控转录因子p50、CREB和AP1促进IL-10表达 | 第64-65页 |
| 5.3.4 PCV2 感染后期通过激活 p38 MAPK 和 ERK 信号途径促进 IL-10 表达 | 第65-66页 |
| 5.3.5 PCV2 Cap 蛋白是上调猪肺泡巨噬细胞中 IL-10 表达的关键组分 | 第66-67页 |
| 5.3.6 PCV2 Cap 蛋白激活 PI3K/Akt、ERK 和 p38 MAPK 信号途径 | 第67-68页 |
| 5.3.7 PCV2 Cap 蛋白与宿主蛋白 gC1q R 结合促进 IL-10 表达 | 第68-71页 |
| 5.3.8 PCV2 Cap 与 gC1qR 结合激活 PI3K/Akt和 p38 MAPK 信号途径 | 第71-73页 |
| 5.4 讨论 | 第73-76页 |
| 5.5 小结 | 第76-77页 |
| 第六章 猪圆环病毒2型对猪肺泡巨噬细胞 IL-12p40 表达的影响及调控机制 | 第77-88页 |
| 6.1 材料 | 第77-78页 |
| 6.1.1 毒株及细胞株 | 第77页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第77-78页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第78页 |
| 6.2 方法 | 第78-80页 |
| 6.2.1 试验动物分组 | 第78页 |
| 6.2.2 猪肺泡巨噬细胞分离 | 第78页 |
| 6.2.3 猪肺泡巨噬细胞极化的体外刺激 | 第78页 |
| 6.2.4 PCV2 感染巨噬细胞中 LPS/IFN-γ 诱导 IL-12p40 的生成 | 第78页 |
| 6.2.5 流式细胞术检测 | 第78-79页 |
| 6.2.6 巨噬细胞相关基因 mRNA 检测 | 第79页 |
| 6.2.7 miRNA 的定量 PCR 检测 | 第79-80页 |
| 6.2.8 miRNA mimics和inhibitor 的转染 | 第80页 |
| 6.2.9 数据分析 | 第80页 |
| 6.3 结果 | 第80-85页 |
| 6.3.1 PCV2 感染导致猪肺泡巨噬细胞减少 | 第80-81页 |
| 6.3.2 PCV2 感染诱导猪肺泡巨噬细胞极化为 M2 型 | 第81-83页 |
| 6.3.3 PCV2 感染猪肺泡巨噬细胞抑制 IL-12p40 表达 | 第83-84页 |
| 6.3.4 PCV2 感染猪肺泡巨噬细胞上调 miRNA-23a/b 的表达 | 第84-85页 |
| 6.4 讨论 | 第85-87页 |
| 6.5 小结 | 第87-88页 |
| 结论与创新点 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-101页 |
| 英文缩略词及中英文对照 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 作者简介 | 第104-105页 |
