| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-28页 |
| 参考文献 | 第21-28页 |
| 第二部分 实验研究 | 第28-70页 |
| 第一章 抗CD47纳米抗体及单链抗体的制备 | 第28-48页 |
| 1 实验材料 | 第29-31页 |
| 1.1 菌种及质粒 | 第29页 |
| 1.2 引物与试剂 | 第29-30页 |
| 1.3 培养基及溶液配制 | 第30-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.1 CD47抗原的制备及鉴定 | 第31-33页 |
| 2.1.1 PCR扩增CD47的胞外区片段 | 第31-32页 |
| 2.1.2 CD47胞外区构建到p ET30a载体 | 第32页 |
| 2.1.3 BL21-p ET30a-CD47-ECD蛋白的诱导表达及鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2 噬菌体展示文库筛选抗CD47的纳米抗体 | 第33-37页 |
| 2.2.1 M13K07辅助噬菌体的扩增及滴度测定 | 第33-34页 |
| 2.2.2 噬菌体展示文库筛选抗CD47的纳米抗体 | 第34-35页 |
| 2.2.3 单克隆噬菌体ELISA及测序分析验证阳性克隆 | 第35-36页 |
| 2.2.4 阳性克隆即纳米抗体进行诱导表达纯化蛋白 | 第36-37页 |
| 2.3 B6H12-sc Fv单链抗体基因的设计、构建和在大肠杆菌中的表达纯化 | 第37页 |
| 2.3.1 B6H12-sc Fv单链抗体基因的设计 | 第37页 |
| 2.3.2 B6H12-sc Fv单链抗体在大肠杆菌中的表达纯化 | 第37页 |
| 3 结果及分析 | 第37-45页 |
| 3.1 BL21-p ET30a-CD47-ECD原核表达载体的构建及原核蛋白的表达纯化 | 第37-39页 |
| 3.2 Western blot鉴定原核表达的蛋白BL21-p ET30a-CD47 | 第39页 |
| 3.3 噬菌体展示文库筛选抗CD47的纳米抗体 | 第39-42页 |
| 3.3.1 M13K07辅助噬菌体滴度的测定 | 第39-40页 |
| 3.3.2 噬菌体展示文库的扩增滴度测定 | 第40页 |
| 3.3.3 VHH噬菌体展示文库的筛选及初步鉴定 | 第40-42页 |
| 3.4 噬菌体展示文库筛选出的阳性克隆鉴定 | 第42-45页 |
| 3.4.1 单克隆噬菌体ELISA鉴定筛选出的阳性克隆 | 第42页 |
| 3.4.2 测序结果分析 | 第42-43页 |
| 3.4.3 抗CD47纳米抗体的诱导表达及纯化 | 第43-45页 |
| 3.5 抗CD47单链抗体（B6H12-sc Fv）重组蛋白在大肠杆菌胞质中可溶性表达 | 第45页 |
| 4 讨论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-48页 |
| 第二章 抗CD47抗体的体外结合活性验证 | 第48-64页 |
| 1 实验材料 | 第49页 |
| 1.1 细胞与实验动物 | 第49页 |
| 1.2 抗体与试剂 | 第49页 |
| 1.3 培养基与溶液配制 | 第49页 |
| 2 实验方法 | 第49-54页 |
| 2.1 抗CD47纳米抗体的结合活性研究 | 第49-50页 |
| 2.1.1 ELISA检验纳米抗体与抗原的亲和力 | 第49-50页 |
| 2.1.2 Western blot验证纳米抗体与抗原的结合能力 | 第50页 |
| 2.1.3 抗CD47纳米抗体亲和力的测定 | 第50页 |
| 2.2 ELISA和Western blot检测B6H12-sc Fv与CD47抗原的结合 | 第50-51页 |
| 2.3 流式细胞术检测食管癌细胞EC9706表面CD47的表达 | 第51-52页 |
| 2.4 细胞ELISA验证EC9706细胞表面CD47与B6H12-sc Fv的结合 | 第52页 |
| 2.5 流式细胞术检测B6H12-sc Fv与EC9706细胞表面CD47的结合 | 第52页 |
| 2.6 竞争ELISA检测B6H12-sc Fv对CD47结合SIRPα的阻断作用 | 第52-53页 |
| 2.7 促吞噬实验验证B6H12-sc Fv促进巨噬细胞对食管癌细胞的吞噬 | 第53-54页 |
| 2.7.1 原代培养巨噬细胞 | 第53页 |
| 2.7.2 台盼蓝染色鉴定细胞活力 | 第53页 |
| 2.7.3 巨噬细胞吞噬能力检测 | 第53-54页 |
| 3 实验结果 | 第54-62页 |
| 3.1 ELISA验证抗CD47的纳米抗体与CD47的结合活性 | 第54-55页 |
| 3.2 Western blot验证抗CD47的纳米抗体与CD47的结合能力 | 第55-56页 |
| 3.3 纳米抗体亲和力的测定 | 第56页 |
| 3.4 B6H12-sc Fv真核表达及原核表达的CD47重组蛋白结合的特异性 | 第56-57页 |
| 3.5 流式细胞术检测肿瘤细胞表面CD47的表达 | 第57-58页 |
| 3.6 细胞ELISA检测B6H12-sc Fv与细胞表面CD47的结合 | 第58-59页 |
| 3.7 流式细胞术检测B6H12-sc Fv与细胞表面CD47的结合 | 第59页 |
| 3.8 竞争ELISA表明B6H12-sc Fv对CD47结合SIRPα具有阻断作用 | 第59-60页 |
| 3.9 抗CD47单链抗体的促吞噬作用 | 第60-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-64页 |
| 第三章 抗CD47抗体对裸鼠人食管癌异种移植肿瘤的抑制作用 | 第64-70页 |
| 1 材料与方法 | 第64-65页 |
| 1.1 材料 | 第64页 |
| 1.2 实验方法 | 第64-65页 |
| 1.2.1 食管癌细胞的收集 | 第64-65页 |
| 1.2.2 建立人食管癌异种移植瘤小鼠模型 | 第65页 |
| 1.2.3 抗CD47抗体对人食管癌异种移植肿瘤的裸鼠治疗 | 第65页 |
| 1.2.4 数据处理及分析 | 第65页 |
| 2 结果 | 第65-68页 |
| 2.1 食管癌细胞的培养 | 第65-66页 |
| 2.2 食管癌小鼠肿瘤模型的建立 | 第66页 |
| 2.3 抗CD47抗体在食管癌小鼠的治疗效果 | 第66页 |
| 2.4 统计学分析小鼠瘤块的体积及肿瘤重量 | 第66-68页 |
| 3 讨论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-70页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第70-71页 |
| 展望 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 个人简历 | 第72页 |
| 参与课题及发表文章 | 第72-73页 |
