| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-29页 |
| 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类和介绍 | 第15-17页 |
| 1.1 经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂 | 第16页 |
| 1.2 非经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂 | 第16页 |
| 1.3 Serpin(serine protease inhibitors)类抑制剂 | 第16-17页 |
| 2 CMTI的结构 | 第17-19页 |
| 3 CMTI的酶学特性 | 第19-21页 |
| 3.1 CMTI的作用机制 | 第19页 |
| 3.2 蛋白酶-抑制剂复合物 | 第19-20页 |
| 3.3 P_1位 | 第20-21页 |
| 4 胰蛋白酶抑制剂的应用 | 第21-22页 |
| 4.1 抑制肿瘤增殖 | 第21页 |
| 4.2 抑制肿瘤的浸润与转移 | 第21-22页 |
| 4.3 用于治疗胰腺炎 | 第22页 |
| 5 酵母体系表达丝氨酸蛋白酶蛋白抑制剂概况 | 第22-27页 |
| 5.1 原核表达系统的不足之处 | 第22-23页 |
| 5.2 真核表达系统的优势 | 第23-24页 |
| 5.3 采用Pp表达体系对TI进行表达的影响因素 | 第24-25页 |
| 5.3.1 启动子选择 | 第24页 |
| 5.3.2 分泌表达 | 第24-25页 |
| 5.3.3 翻译后修饰 | 第25页 |
| 5.3.4 产物稳定性 | 第25页 |
| 5.4 提高TI在Pp中表达量的策略 | 第25-26页 |
| 5.4.1 启动子的影响 | 第26页 |
| 5.4.2 外源基因拷贝数的影响 | 第26页 |
| 5.5 发酵工艺的优化 | 第26-27页 |
| 5.5.1 建立稳定的菌株 | 第26页 |
| 5.5.2 培养条件的优化 | 第26-27页 |
| 6 本课题拟研究的问题 | 第27-29页 |
| 第二章 不同发酵参数对rCMTI Ⅰ表达的影响研究 | 第29-43页 |
| 1 材料 | 第29-30页 |
| 1.1 菌种 | 第29页 |
| 1.2 试剂及溶液配制 | 第29-30页 |
| 1.2.1 主要试剂 | 第29页 |
| 1.2.2 溶液配制 | 第29-30页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第30页 |
| 2.方法 | 第30-36页 |
| 2.1 菌种的纯化和扩增 | 第30-32页 |
| 2.1.1 种子培养基 | 第31页 |
| 2.1.2 发酵培养基 | 第31页 |
| 2.1.3 菌种的纯化 | 第31页 |
| 2.1.4 种子液的制备 | 第31页 |
| 2.1.5 rCMTI的动态抑制活力测定 | 第31-32页 |
| 2.2 BMGY和BMMY两种培养基对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响试验 | 第32页 |
| 2.2.1 培养基配比 | 第32页 |
| 2.2.2 发酵试验 | 第32页 |
| 2.3 不同因素对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响试验 | 第32-34页 |
| 2.3.1 酵母氮源对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第32-33页 |
| 2.3.1.1 培养基配比 | 第33页 |
| 2.3.1.2 发酵试验 | 第33页 |
| 2.3.2 pH对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第33页 |
| 2.3.2.1 不同pH值培养基的配制 | 第33页 |
| 2.3.2.2 发酵试验 | 第33页 |
| 2.3.3 Mg~(2+)对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第33-34页 |
| 2.3.3.1 培养基的配制 | 第34页 |
| 2.3.3.2 发酵试验 | 第34页 |
| 2.3.4 培养基浓度对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第34页 |
| 2.3.4.1 培养基配比 | 第34页 |
| 2.3.4.2 发酵试验 | 第34页 |
| 2.4 发酵条件组成的正交优化 | 第34-35页 |
| 2.4.1 各因素水平 | 第35页 |
| 2.4.2 发酵试验 | 第35页 |
| 2.5 最佳组合的重现性试验 | 第35页 |
| 2.6 无机盐培养基对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响试验 | 第35-36页 |
| 2.6.1 无机盐培养基配制 | 第35页 |
| 2.6.2 发酵试验 | 第35-36页 |
| 3 结果 | 第36-40页 |
| 3.1 BMGY、BMMY和YPD培养基对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响 | 第36页 |
| 3.2 不同因素对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响试验 | 第36-38页 |
| 3.2.1 酵母氮源对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第36-37页 |
| 3.2.2 pH对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第37页 |
| 3.2.3 Mg~(2+)对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第37-38页 |
| 3.2.4 培养基主要营养成分浓度对rCMTI Ⅰ表达的影响 | 第38页 |
| 3.3 发酵条件组成的正交试验结果 | 第38-39页 |
| 3.4 最佳组合的重现性试验 | 第39-40页 |
| 3.5 无机盐培养基对毕赤酵母工程菌表达rCMTI Ⅰ的影响试验 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-43页 |
| 第三章 rCMTI Ⅰ亲和层析介质的制备及rCMTI分离纯化工艺的研究 | 第43-63页 |
| 1 材料 | 第43-45页 |
| 1.1 试剂及溶液配制 | 第43-44页 |
| 1.1.1 主要试剂 | 第43-44页 |
| 1.1.2 溶液配制 | 第44页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第44-45页 |
| 2 方法 | 第45-51页 |
| 2.1 黏胶纤维作为亲和吸附载体的制备 | 第45-46页 |
| 2.1.1 黏胶纤维的活化 | 第45页 |
| 2.1.2 胰蛋白酶活力测定 | 第45-46页 |
| 2.2 胰蛋白酶固定化条件的确定 | 第46页 |
| 2.2.1 加酶量的选择 | 第46页 |
| 2.2.2 固定化温度的确定 | 第46页 |
| 2.2.3 酶液的pH值对固定化效果的影响试验 | 第46页 |
| 2.2.4 酶固定化反应时间与固定化效果的关系研究 | 第46页 |
| 2.3 亲和介质的性质研究 | 第46-47页 |
| 2.3.1 酶活力的测定 | 第46-47页 |
| 2.3.1.1 自由酶的活力测定 | 第47页 |
| 2.3.1.2 固定酶的活力测定 | 第47页 |
| 2.3.2 亲和介质的最适作用温度 | 第47页 |
| 2.3.3 亲和介质的最适使用pH值确定 | 第47页 |
| 2.3.4 亲和介质的热稳定性研究 | 第47页 |
| 2.3.5 亲和介质对酸碱的稳定性 | 第47页 |
| 2.4 rCMTI Ⅰ的表达 | 第47-48页 |
| 2.5 rCMTI Ⅰ的分离纯化 | 第48-49页 |
| 2.5.1 亲合层析介质的制备 | 第48页 |
| 2.5.2 亲合层析介质交联率的测定 | 第48-49页 |
| 2.5.2.1 标准曲线的制定 | 第48-49页 |
| 2.5.2.2 测定上清和洗脱液中的蛋白 | 第49页 |
| 2.5.3 rCMTI Ⅰ的分离纯化 | 第49页 |
| 2.5.4 层析柱的最大上样量 | 第49页 |
| 2.6 亲和洗脱样品的脱盐 | 第49页 |
| 2.7 目的蛋白的鉴定 | 第49-51页 |
| 2.7.1 Tricine-SDS-PAGE | 第49-50页 |
| 2.7.2 rCMTI Ⅰ抑制活性测定 | 第50-51页 |
| 2.8 亲和层析样品的纯化 | 第51页 |
| 2.8.1 纯化样品抑制活性测定 | 第51页 |
| 2.8.2 纯化样品Tricine-SDS-PAGE | 第51页 |
| 3 结果 | 第51-61页 |
| 3.1 黏胶纤维作为亲和吸附载体的制备 | 第51-52页 |
| 3.1.1 黏胶纤维的环氧氯丙烷活化 | 第51-52页 |
| 3.1.2 胰蛋白酶活力测定 | 第52页 |
| 3.1.2.1 标准曲线 | 第52页 |
| 3.1.2.2 胰蛋白酶活力 | 第52页 |
| 3.2 胰蛋白酶固定化条件的确定 | 第52-54页 |
| 3.2.1 加酶量的选择 | 第52-53页 |
| 3.2.2 固定化温度的确定 | 第53页 |
| 3.2.3 酶液的pH值对固定化效果的影响 | 第53-54页 |
| 3.2.4 反应时间与固定化效果的关系 | 第54页 |
| 3.3 亲和介质的性质研究 | 第54-56页 |
| 3.3.1 亲和介质的最适作用温度 | 第54-55页 |
| 3.3.2 亲和介质的最适使用pH值 | 第55页 |
| 3.3.3 亲和介质的热稳定性 | 第55-56页 |
| 3.3.4 亲和介质对酸碱的稳定性 | 第56页 |
| 3.4 CMTI Ⅰ的表达 | 第56-57页 |
| 3.5 CMTI Ⅰ的分离纯化 | 第57-58页 |
| 3.5.1 亲合层析介质交联率的测定 | 第57页 |
| 3.5.1.1 标准曲线 | 第57页 |
| 3.5.1.2 亲和介质交联率的测定 | 第57页 |
| 3.5.2 亲和层析柱层析分离 | 第57-58页 |
| 3.5.3 层析柱的最大上样量 | 第58页 |
| 3.6 亲和洗脱样品的脱盐 | 第58-59页 |
| 3.7 目的蛋白的鉴定 | 第59-60页 |
| 3.7.1 Tricine-SDS-PAGE | 第59页 |
| 3.7.2 CMTI Ⅰ抑制活性测定 | 第59-60页 |
| 3.8 亲和层析样品的纯化 | 第60-61页 |
| 3.8.1 纯化样品抑制活性测定 | 第60-61页 |
| 3.8.2 纯化样品Tricine-SDS-PAGE | 第61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 第四章 rCMTI Ⅰ的抑瘤活性研究 | 第63-74页 |
| 1 材料 | 第63-64页 |
| 1.1 细胞株 | 第63页 |
| 1.2 试剂 | 第63-64页 |
| 1.3 主要仪器 | 第64页 |
| 2 方法 | 第64-65页 |
| 2.1 rCMTI Ⅰ抑制肿瘤细胞增殖作用研究 | 第64-65页 |
| 2.1.1 PG细胞和MDA细胞的复苏、培养及传代 | 第64页 |
| 2.1.2 MTT比色法测定细胞增殖 | 第64-65页 |
| 2.2 rCMTI Ⅰ体外抑制肿瘤细胞降解细胞外基质研究 | 第65页 |
| 2.2.1 基底膜屏障的建立及标记 | 第65页 |
| 2.2.2 rCMTI Ⅰ抑制肿瘤细胞降解基底膜屏障试验 | 第65页 |
| 3 结果 | 第65-72页 |
| 3.1 rCMTI Ⅰ对肺癌PG细胞的增殖抑制作用 | 第65-70页 |
| 3.2 rCMTI Ⅰ对MDA细胞增殖的抑制作用 | 第70-71页 |
| 3.3 rCMTI Ⅰ对PG细胞抑制作用的时间效应 | 第71页 |
| 3.4 rCMTI对MDA细胞抑制作用的时间效应 | 第71页 |
| 3.5 rCMTI Ⅰ抑制PG细胞降解细胞外基质作用 | 第71-72页 |
| 3.6 rCMTI抑制MDA细胞降解细胞外基质作用 | 第72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 总结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第84-85页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第85页 |
