| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 摘要 | 第8-15页 |
| LIST OF FIGURES | 第15-17页 |
| LIST OF TABLES | 第17-18页 |
| Abbrivations | 第18-19页 |
| Chapter Ⅰ: Introduction | 第19-50页 |
| 1.1 Bifidobacteria | 第19-20页 |
| 1.2 Gene expression in Bifidobacteria | 第20-29页 |
| 1.3 Functional assay of probiotic organisms | 第29-34页 |
| 1.4 Protein secretion in lactic acid bacteria/bifidobacteria | 第34-44页 |
| 1.4.1 Sec system | 第37-38页 |
| 1.4.2 Components of sec system | 第38-44页 |
| 1.5 Signal peptides | 第44-46页 |
| 1.6 Vaccine delivery | 第46页 |
| 1.7 IL-10 gene | 第46-48页 |
| 1.8 The aim of this study | 第48-49页 |
| 1.9 The general research technique route | 第49-50页 |
| Chapter Ⅱ: Homologous sHsp expression in bifidobacterium longum NCC2705 | 第50-75页 |
| 2.1 Introduction | 第50-52页 |
| 2.2 Materials and Methods | 第52-63页 |
| 2.2.1. Bacterial strains,plasmids,and culture conditions | 第52页 |
| 2.2.2 Media preparation | 第52-53页 |
| 2.2.3 Antibiotics | 第53页 |
| 2.2.4 IPTG and X-gal solution | 第53页 |
| 2.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents | 第53-55页 |
| 2.2.6 Reagents for DNA extraction | 第55-57页 |
| 2.2.7 DNA extraction of B.longum NCC2705 | 第57-58页 |
| 2.2.8 TAE Agarose Gel Electrophoresis analysis | 第58页 |
| 2.2.9 Cloning of hsp20(BL0576)from B.longum strain NCC2705 | 第58页 |
| 2.2.10 Recycling/Purification of PCR products | 第58页 |
| 2.2.11 TA cloning PCR products of homologous shp 20 gene | 第58-59页 |
| 2.2.12 Transformation of PCR products into E.coli DH5α | 第59页 |
| 2.2.13 Preparation of Plasmid DNA and quantification of DNA | 第59页 |
| 2.2.14 Digestion of DNA | 第59页 |
| 2.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA | 第59-60页 |
| 2.2.16 Ligation reaction | 第60页 |
| 2.2.17 Construction of expression vector and transformation | 第60页 |
| 2.2.18 Assay of stress tolerance of hsp20-overproducing B.longum NCC2705 | 第60-61页 |
| 2.2.19 Quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR) | 第61-62页 |
| 2.2.20 Statistical Analysis | 第62-63页 |
| 2.3 Results | 第63-71页 |
| 2.3.1 Cloning of homologous hsp 20(sHsp)gene and construction of homologous expression cassette | 第63页 |
| 2.3.2 Overexpression of hsp20(sHsp)in B.longum NCC2705 | 第63-65页 |
| 2.3.3 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC2705 | 第65-67页 |
| 2.3.4 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC2705 | 第67-68页 |
| 2.3.5 Multiple stress tolerance of hsp20-overexpressing B.longum NCC2705 | 第68-71页 |
| 2.4 Discussion | 第71-74页 |
| 2.5 Summary | 第74-75页 |
| Chapter Ⅲ: Heterologous IL-10 transformation in Bifidobacterium longum NCC2705 | 第75-89页 |
| 3.1 Introduction | 第75-77页 |
| 3.2 Materials and Methods | 第77-82页 |
| 3.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions | 第77页 |
| 3.2.2 Media preparation | 第77-78页 |
| 3.2.3 Antibiotics | 第78页 |
| 3.2.4 IPTG and X-gal | 第78-79页 |
| 3.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents | 第79页 |
| 3.2.6 Reagents for DNA extraction | 第79页 |
| 3.2.7 DNA extraction of B.longum NCC2705 | 第79页 |
| 3.2.8 Cloning of expression cassette(PGAP-IL10-Thup)from pESH93 | 第79页 |
| 3.2.9 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis | 第79页 |
| 3.2.10 Recycling/Purification of PCR products | 第79-80页 |
| 3.2.11 TA cloning of IL-10 gene | 第80页 |
| 3.2.12 Transformation of heterologous IL-10 into E.coli DH5α | 第80页 |
| 3.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA | 第80页 |
| 3.2.14 Digestion of DNA | 第80页 |
| 3.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA | 第80页 |
| 3.2.16 Ligation reaction | 第80页 |
| 3.2.17 Heterologous IL-10 expression vector construction and transformation in B.longum NCC | 第80-81页 |
| 3.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR | 第81-82页 |
| 3.3 Results | 第82-87页 |
| 3.3.1 pDP870-IL-10 expression vector | 第82-84页 |
| 3.3.2 Transformation of expression vectors in B.longum NCC2705 | 第84页 |
| 3.3.3 Semi-quantitative reverse transcription of IL-10 gene | 第84-87页 |
| 3.4 Discussion | 第87-88页 |
| 3.5 Summary | 第88-89页 |
| Chapter Ⅳ: Modification of Sec-system of Bifidobacterium longum NCC2705 | 第89-109页 |
| 4.1 Introduction | 第89-91页 |
| 4.2. Materials and Methods | 第91-98页 |
| 4.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions | 第91-93页 |
| 4.2.2 Media preparation | 第93页 |
| 4.2.3 Antibiotics | 第93-94页 |
| 4.2.4 IPTG and X-gal | 第94页 |
| 4.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents | 第94页 |
| 4.2.6 Reagents for DNA extraction | 第94页 |
| 4.2.7 DNA extraction of B.longum NCC2705 | 第94页 |
| 4.2.8 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis | 第94页 |
| 4.2.9 Cloning of heterologous secDF and construction of expression vector | 第94-95页 |
| 4.2.10 Recycling/Purification of PCR products | 第95页 |
| 4.2.11 TA cloning of heterologous secDF | 第95页 |
| 4.2.12 Transformation of heterologous sec DF into E.coli DH5α | 第95页 |
| 4.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA | 第95页 |
| 4.2.14 Digestion of DNA | 第95-96页 |
| 4.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA | 第96页 |
| 4.2.16 Ligation reaction | 第96页 |
| 4.2.17 Modification of sec system in B.longum NCC2705 | 第96页 |
| 4.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR | 第96-98页 |
| 4.3 Results | 第98-105页 |
| 4.3.1 pDP870-SecDF expression vector | 第98-100页 |
| 4.3.2 pDP870-SecDF-IL10 expression vector | 第100-101页 |
| 4.3.3 Transformation of expression vectors and modification of sec machinery in Bifidobacterium longum NCC2705 | 第101-103页 |
| 4.3.4 RNA isolation and semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction | 第103-105页 |
| 4.4 Discussion | 第105-107页 |
| 4.5 Summary | 第107-109页 |
| Chapter Ⅴ: Protein expression and function assay in sec-System modified Bifidobacterium longum NCC2705 | 第109-125页 |
| 5.1 Introduction | 第109-111页 |
| 5.2 Material and methods | 第111-117页 |
| 5.2.1 Strains, reagents and solutions | 第111-112页 |
| 5.2.2 Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis | 第112-113页 |
| 5.2.3 Preparation of bacterial cell fractions | 第113页 |
| 5.2.4 TCA precipitation of supernatant protein | 第113-114页 |
| 5.2.5 Coomassie staining | 第114页 |
| 5.2.6 Western blotting | 第114页 |
| 5.2.7 Binding of transferred protein with specific antibodies | 第114-115页 |
| 5.2.8 Culture condition and epithelial HT-29 cell line application on sec modified Bifidobacterial strains | 第115-117页 |
| 5.3 Results | 第117-122页 |
| 5.3.1 Protein secretion of B. longum NCC2705 | 第117-118页 |
| 5.3.2 Western blot analysis for IL-10 secretion in B. longum NCC2705 | 第118-120页 |
| 5.3.3 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by Sec-modified transformant | 第120-122页 |
| 5.4 Discussion | 第122-124页 |
| 5.5 Summary | 第124-125页 |
| Chapter Ⅵ: Summary, conclusion and suggestion | 第125-132页 |
| 6.1 Summary | 第125-130页 |
| 6.1.1 Overexpression of sHsp(hsp 20 BL05763) in B. longum NCC2705 | 第125页 |
| 6.1.2 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705 | 第125-126页 |
| 6.1.3 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705 | 第126页 |
| 6.1.4 Multiple stress tolerance of Hsp20-overexpressing B. longum NCC2705 | 第126-127页 |
| 6.1.5 pDP870-IL-10 expression vector | 第127页 |
| 6.1.6 Transformation of heterologous IL-10 expression vector in B. longum NCC2705 | 第127页 |
| 6.1.7 RNA isolation and sqRT-PCR for IL-10 | 第127页 |
| 6.1.8 pDP870-secDFexpression vector | 第127-128页 |
| 6.1.9 pDP870-secDF-IL-10 co-expression vector | 第128页 |
| 6.1.10 Transformation of expression vector and modification of sec machinary in B.longum NCC2705 | 第128页 |
| 6.1.11 RNA isolation and sqRT-PCR for secDF and IL-10 | 第128页 |
| 6.1.12 Protein expression in B.longum NCC2705 | 第128-129页 |
| 6.1.13 Western blot | 第129页 |
| 6.1.14 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by sec-modified transformant | 第129-130页 |
| 6.2 Conclusion | 第130-131页 |
| 6.3 Suggestion | 第131-132页 |
| Literature cited | 第132-152页 |
| Acknowledgements | 第152-154页 |
| Curriculum Vitae | 第154-156页 |
