| 中文摘要 | 第12-14页 |
| 英文摘要 | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第18-32页 |
| 1.1 奶牛乳腺发育与泌乳 | 第18-19页 |
| 1.2 奶牛乳蛋白合成功能基因及基因组研究 | 第19-21页 |
| 1.3 奶牛乳蛋白合成主要信号转导途径研究 | 第21-24页 |
| 1.3.1 JAK-Stat5信号通路 | 第21-22页 |
| 1.3.2 mTOR信号通路 | 第22-24页 |
| 1.4 氨基酸对泌乳的调节作用 | 第24-25页 |
| 1.5 氨基酰tRNA合成酶的功能研究 | 第25-31页 |
| 1.5.1 氨酰tRNA合成酶的基本结构与功能 | 第25-26页 |
| 1.5.2 氨酰tRNA合成酶的新功能 | 第26-28页 |
| 1.5.3 甘氨酰tRNA合成酶的结构与功能 | 第28-31页 |
| 1.6 实验目的与意义 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-59页 |
| 2.1 实验材料 | 第32-33页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第32页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第32-33页 |
| 2.1.3 实验动物与细胞 | 第33页 |
| 2.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 | 第34页 |
| 2.3 添加蛋氨酸泌乳模型中GlyRS的表达与定位 | 第34-36页 |
| 2.3.1 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立 | 第34页 |
| 2.3.2 泌乳模型中GlyRS的表达与定位 | 第34-36页 |
| 2.4 不同氨基酸对CSN2及不同氨基酰tRNA合成酶表达的影响 | 第36-37页 |
| 2.4.1 细胞处理 | 第36页 |
| 2.4.2 qRT-PCR检测各处理组细胞中CSN2、GlyRS、MetRS和LeuRS的表达 | 第36-37页 |
| 2.5 GlyRS对乳蛋白合成信号通路及细胞增殖的影响 | 第37-42页 |
| 2.5.1 GlyRS过表达对乳蛋白合成信号通路的影响 | 第37-40页 |
| 2.5.2 GlyRS过表达对细胞增殖的影响 | 第40-41页 |
| 2.5.3 GlyRS抑制对乳蛋白合成信号通路的影响 | 第41-42页 |
| 2.5.4 GlyRS抑制对细胞增殖的影响 | 第42页 |
| 2.6 GlyRS的入核机制分析 | 第42-45页 |
| 2.6.1 WB分析GlyRS的剪切及入核 | 第43页 |
| 2.6.2 点突变分析GlyRS的核引导序列 | 第43-45页 |
| 2.7 细胞浆中GlyRS的相互作用蛋白分析 | 第45-51页 |
| 2.7.1 胞浆蛋白的提取 | 第45页 |
| 2.7.2 免疫共沉淀分析胞浆中GlyRS的相互作用蛋白 | 第45-49页 |
| 2.7.3 胞浆中GlyRS Co-IP蛋白磷酸化质谱结果的分析 | 第49页 |
| 2.7.4 胞浆中GlyRS相互作用蛋白的WB验证 | 第49-50页 |
| 2.7.5. 激光能量共振转移分析胞浆中GlyRS的相互作用蛋白 | 第50页 |
| 2.7.6 胞浆中GlyRS相互作用蛋白的定量免疫共沉淀分析 | 第50-51页 |
| 2.7.7 胞浆中GlyRS相互作用蛋白的激光共聚焦共定位分析 | 第51页 |
| 2.7.8 GlyRS过表达对胞浆中相互作用蛋白的影响 | 第51页 |
| 2.7.9 GlyRS抑制对胞浆中相互作用蛋白的影响 | 第51页 |
| 2.8 细胞核中GlyRS的相互作用蛋白分析 | 第51-56页 |
| 2.8.1 胞核蛋白的提取 | 第51页 |
| 2.8.2 免疫共沉淀分析胞核中GlyRS的相互作用蛋白 | 第51页 |
| 2.8.3 胞核中GlyRS Co-IP磷酸化质谱结果的分析 | 第51页 |
| 2.8.4 胞核中GlyRS相互作用蛋白的WB验证 | 第51-52页 |
| 2.8.5 激光能量共振转移分析胞核中GlyRS的相互作用蛋白 | 第52-53页 |
| 2.8.6 胞核中GlyRS相互作用蛋白的定量免疫共沉淀分析 | 第53页 |
| 2.8.7 胞核中GlyRS相互作用蛋白的激光共聚焦共定位分析 | 第53页 |
| 2.8.8 GlyRS过表达对胞核中相互作用蛋白的影响 | 第53页 |
| 2.8.9 GlyRS抑制对胞核中相互作用蛋白的影响 | 第53页 |
| 2.8.10 胞核中相互作用蛋白过表达对CSN2的影响 | 第53-54页 |
| 2.8.11 点突变分析GlyRS的磷酸化位点对其入核的影响 | 第54-55页 |
| 2.8.12 GlyRS与相互作用蛋白相互作用的定位 | 第55-56页 |
| 2.9 染色质免疫共沉淀分析GlyRS及其相互作用蛋白与CSN2启动子的结合 | 第56-58页 |
| 2.9.1 染色质免疫共沉淀分析GlyRS与CSN2启动子的结合 | 第56-58页 |
| 2.9.2 染色质免疫共沉淀分析NFκB1与CSN2启动子的结合 | 第58页 |
| 2.9.3 NFκB1与CSN2启动子结合的核酸序列分析 | 第58页 |
| 2.10 数据分析 | 第58-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-98页 |
| 3.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定 | 第59-61页 |
| 3.2 添加蛋氨酸对GlyRS的表达与定位的影响 | 第61-64页 |
| 3.2.1 添加蛋氨酸的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立 | 第61-62页 |
| 3.2.2 添加蛋氨酸对GlyRS表达与定位的影响 | 第62-64页 |
| 3.3 不同氨基酸对CSN2及不同氨基酰tRNA合成酶表达的影响 | 第64-66页 |
| 3.3.1 八种必需氨基酸和甘氨酸对CSN2 mRNA表达的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.2 八种必需氨基酸和甘氨酸对GlyRS mRNA表达的影响 | 第65页 |
| 3.3.3 八种必需氨基酸和甘氨酸对MetRS mRNA表达的影响 | 第65-66页 |
| 3.3.4 八种必需氨基酸和甘氨酸对LeuRS mRNA表达的影响 | 第66页 |
| 3.4 GlyRS对泌乳信号通路及细胞增殖的影响 | 第66-77页 |
| 3.4.1 GlyRS过表达载体的构建及细胞转染 | 第66-67页 |
| 3.4.2 GlyRS过表达对泌乳信号通路的影响 | 第67-70页 |
| 3.4.3 GlyRS过表达对细胞增殖的影响 | 第70-71页 |
| 3.4.4 GlyRS抑制对泌乳信号通路的影响 | 第71-75页 |
| 3.4.5 GlyRS抑制对细胞增殖的影响 | 第75-77页 |
| 3.5 GlyRS的入核机制分析 | 第77-79页 |
| 3.5.1 WB验证GlyRS的剪切及入核 | 第77-78页 |
| 3.5.2 点突变分析GlyRS的核引导序列 | 第78-79页 |
| 3.6 胞浆中GlyRS的蛋白质相互作用分析 | 第79-86页 |
| 3.6.1 免疫共沉淀分析胞浆中GlyRS的相互作用蛋白 | 第79-81页 |
| 3.6.2 激光能量共振转移验证GlyRS与eEF1A1、e1F2D的相互作用 | 第81-83页 |
| 3.6.3 定量免疫共沉淀分析GlyRS与eEF1A1、eIF2D的相互作用 | 第83-84页 |
| 3.6.4 激光共聚焦共定位分析GlyRS与eEF1A1、eIF2D的相互作用 | 第84-85页 |
| 3.6.5 GlyRS过表达对eEF1A1和eIF2D的影响 | 第85-86页 |
| 3.6.6 GlyRS抑制对eEF1A1和eIF2D的影响 | 第86页 |
| 3.7 胞核中GlyRS的蛋白质相互作用分析 | 第86-94页 |
| 3.7.1 免疫共沉淀分析胞核中GlyRS的相互作用蛋白 | 第86-88页 |
| 3.7.2 激光能量共振转移验证GlyRS与NFκB1的相互作用 | 第88-89页 |
| 3.7.3 定量免疫共沉淀分析GlyRS与NFκB1的相互作用 | 第89-90页 |
| 3.7.4 激光共聚焦共定位分析GlyRS与NFκB1的相互作用 | 第90页 |
| 3.7.5 GlyRS过表达对NFκB1的影响 | 第90-91页 |
| 3.7.6 GlyRS抑制对NFκB1的影响 | 第91页 |
| 3.7.7 NFκB1过表达对CSN2和GlyRS的影响 | 第91-92页 |
| 3.7.8 点突变分析GlyRS的磷酸化位点对其入核的影响 | 第92-93页 |
| 3.7.9 GlyRS与相互作用蛋白相互作用的定位 | 第93-94页 |
| 3.8 染色质免疫共沉淀分析GlyRS、NFκB1与CSN2启动子的结合 | 第94-96页 |
| 3.8.1 CHIP分析GlyRS与CSN2启动子的结合 | 第94-95页 |
| 3.8.2 CHIP分析NFκB1与CSN2启动子的结合 | 第95-96页 |
| 3.8.3 NFκB1与CSN2启动子的结合位点分析 | 第96页 |
| 3.9 总结 | 第96-98页 |
| 4 讨论 | 第98-105页 |
| 4.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养、纯化、鉴定以及加蛋氨酸泌乳模型的建立 | 第98-99页 |
| 4.2 GlyRS表达与定位 | 第99页 |
| 4.3 GlyRS对泌乳信号通路及增殖的影响 | 第99-100页 |
| 4.3.1 GlyRS对泌乳信号通路的影响 | 第99-100页 |
| 4.3.2 GlyRS对细胞增殖的影响 | 第100页 |
| 4.4 GlyRS在胞浆中从翻译水平上对CSN2合成的调控 | 第100-102页 |
| 4.4.1 GlyRS与eEF1A1结合对CSN2合成的调控 | 第100-101页 |
| 4.4.2 GlyRS与eIF2D结合对CSN2合成的调控 | 第101-102页 |
| 4.5 GlyRS在胞核中从转录水平上对CSN2合成的调控 | 第102-105页 |
| 4.5.1 GlyRS的核定位及分子剪切 | 第102页 |
| 4.5.2 GlyRS与NFκB1结合对CSN2合成的调控 | 第102-103页 |
| 4.5.3 CHIP检测胞核中GlyRS对CSN2合成的调控 | 第103页 |
| 4.5.4 GlyRS的磷酸化对GlyRS入核调控的影响 | 第103-105页 |
| 5 结论 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-118页 |
| 附录 | 第118-132页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第132页 |
