| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第1章 前言 | 第14-25页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9概述 | 第14-21页 |
| 1.1.1 CRISPR/CAS技术发展历史 | 第15-16页 |
| 1.1.2 CRISPR/CAS系统基本结构 | 第16页 |
| 1.1.3 CRISPR/CAS系统的类型及其作用机制 | 第16-18页 |
| 1.1.4 sgRNA的设计与选择 | 第18-19页 |
| 1.1.5 脱靶效应及其降低脱靶效率 | 第19页 |
| 1.1.6 CRISPR/CAS9介导的打靶系统的应用 | 第19-21页 |
| 1.2 黑色素瘤和CD44研究概况 | 第21-25页 |
| 第2章 CD44基因靶位点设计及gRNA载体构建 | 第25-37页 |
| 2.1 材料与方法 | 第26-31页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1.1 主要实验试剂 | 第26页 |
| 2.1.1.2 主要实验仪器 | 第26页 |
| 2.1.1.3 实验溶液配制 | 第26-27页 |
| 2.1.1.4 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第27-31页 |
| 2.1.2.1 CD44基因的靶位点设计 | 第27-28页 |
| 2.1.2.2 扩增质粒 | 第28页 |
| 2.1.2.3 载体构建 | 第28-30页 |
| 2.1.2.4 鉴定与测序 | 第30-31页 |
| 2.2 实验结果 | 第31-35页 |
| 2.2.1 CD44基因靶位点确定 | 第31-33页 |
| 2.2.2 sgRNA表达载体构建 | 第33-35页 |
| 2.3 讨论 | 第35-37页 |
| 第3章 电转染法建立CD44蛋白降低B16F10细胞株 | 第37-47页 |
| 3.1 材料与方法 | 第37-42页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.1.1.1 主要实验试剂 | 第37页 |
| 3.1.1.2 主要实验仪器 | 第37页 |
| 3.1.1.3 细胞系 | 第37页 |
| 3.1.1.4 实验溶液配制 | 第37-38页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第38-42页 |
| 3.1.2.1 B16F10细胞培养 | 第38-39页 |
| 3.1.2.2 B16F10细胞转染与Puromycin筛选 | 第39-40页 |
| 3.1.2.3 流式细胞仪检测电转化的B16F10细胞CD44蛋白表达 | 第40-41页 |
| 3.1.2.4 Western Blot验证电转化的B16F10细胞CD44蛋白表达 | 第41-42页 |
| 3.1.2.5 统计学分析处理 | 第42页 |
| 3.2 实验结果 | 第42-45页 |
| 3.2.1 B16F10细胞转染与Puromycin筛选效果 | 第42-43页 |
| 3.2.2 流式细胞仪检测电转化的B16F10细胞CD44蛋白表达效果 | 第43-44页 |
| 3.2.3 Western Blot验证电转化的B16F10细胞CD44蛋白表达效果 | 第44-45页 |
| 3.3 讨论 | 第45-47页 |
| 第4章 CD44蛋白降低对B16F10细胞生物学功能的影响 | 第47-53页 |
| 4.1 材料与方法 | 第47-49页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.1.1.1 主要实验试剂 | 第47页 |
| 4.1.1.2 主要实验仪器 | 第47页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第47-49页 |
| 4.1.2.1 划痕法测定B16F10细胞CD44蛋白降低后B16F10细胞的迁移能力 | 第47-48页 |
| 4.1.2.2 MTT法测定B16F10细胞CD44蛋白降低后B16F10细胞的增殖能力 | 第48页 |
| 4.1.2.3 流式细胞术测定B16F10细胞CD44蛋白降低后对B16F10细胞凋亡的影响 | 第48-49页 |
| 4.1.2.4 统计学分析处理 | 第49页 |
| 4.2 实验结果 | 第49-52页 |
| 4.2.1 划痕法测定B16F10细胞CD44蛋白降低后B16F10细胞的迁移能力效果 | 第49-50页 |
| 4.2.2 MTT法测定B16F10细胞CD44蛋白降低后B16F10细胞的增殖能力效果 | 第50-51页 |
| 4.2.3 流式细胞术测定B16F10细胞CD44蛋白降低后对B16F10细胞凋亡的效果 | 第51-52页 |
| 4.3 讨论 | 第52-53页 |
| 小结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 附录A 实验试剂 | 第60-61页 |
| 附录B 实验仪器 | 第61-62页 |
| 附录C 质粒抽提 | 第62-63页 |
| 附录D 琼脂糖凝胶电泳 | 第63-64页 |
| 附录E DNA凝胶回收 | 第64-65页 |
| 附录F 质粒转化 | 第65-66页 |
| 附录G Western Blot主要试剂 | 第66-68页 |
| 作者简历 | 第68页 |
