| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第19-29页 |
| 1.1 TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制 | 第19-20页 |
| 1.1.1 受体途径 | 第19页 |
| 1.1.2 线粒体途径 | 第19-20页 |
| 1.2 TRAIL诱导的外源性凋亡途径中与耐受直接相关的分子及机制 | 第20-23页 |
| 1.2.1 TRAIL耐受机制及其表达调控 | 第20-21页 |
| 1.2.2 TRAIL受体耐受机制及其表达调控 | 第21-22页 |
| 1.2.3 caspase-8耐受机制及其表达调控 | 第22页 |
| 1.2.4 DISC耐受机制及其调控 | 第22页 |
| 1.2.5 c-FLIP耐受机制及其表达调控 | 第22-23页 |
| 1.3 TRAIL诱导的内源性凋亡途径中与耐受直接相关的分子及机制 | 第23页 |
| 1.3.1 Bcl-2家族蛋白耐受机制及其表达调控 | 第23页 |
| 1.3.2 IAP的耐受机制及其表达调控 | 第23页 |
| 1.4 TRAIL激活的存活途径 | 第23-24页 |
| 1.5 TRAIL与肿瘤治疗 | 第24-25页 |
| 1.6 本实验研究目的 | 第25-26页 |
| 1.7 本实验研究路线 | 第26页 |
| 1.8 用CRISPR-Cas9构建细胞系 | 第26-27页 |
| 1.8.1 最新的基因编辑技术——CRISPR-Cas9技术 | 第26-27页 |
| 1.8.2 CRISPR-Cas9原理 | 第27页 |
| 1.9 利用CRISPR Cas9技术在c-FLIPs序列中敲入GFP | 第27-29页 |
| 1.9.1 构建Pcas-Guide载体 | 第27页 |
| 1.9.2 确定Guide-RNA切割效率 | 第27页 |
| 1.9.3 构建Donor DNA | 第27-28页 |
| 1.9.4 转染 | 第28页 |
| 1.9.5 细胞系的鉴定 | 第28页 |
| 1.9.6 TRAIL处理细胞 | 第28-29页 |
| 第二章 用CRISPR-Cas9技术构建cFLIPs-DED2-GFP细胞系 | 第29-80页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-36页 |
| 2.1.1 载体、菌种及细胞 | 第29页 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 | 第29-30页 |
| 2.1.3 实验实际和药品 | 第30-32页 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 | 第32-36页 |
| 2.2 实验内容与结果 | 第36-80页 |
| 2.2.1 Cas9载体构建 | 第36-45页 |
| 2.2.1.1 gRNA设计 | 第37-38页 |
| 2.2.1.2 提取pCas-Guide质粒 | 第38-40页 |
| 2.2.1.3 质粒pCas-Guide的双酶切体系 | 第40-42页 |
| 2.2.1.4 gRNA引物预处理 | 第42页 |
| 2.2.1.5 连接反应 | 第42-43页 |
| 2.2.1.6 重组载体的转化涂板 | 第43页 |
| 2.2.1.7 菌落PCR、测序保菌 | 第43-45页 |
| 2.2.2 Donor DNA构建 | 第45-70页 |
| 2.2.2.1 pEASY-Blunt- c-FLIP -exon5 -GFP载体构建 | 第46-62页 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1- cFLIPs-exon5 -GFP载体构建 | 第62-68页 |
| 2.2.2.3 去内毒素提取质粒 | 第68-70页 |
| 2.2.3 细胞实验 | 第70-80页 |
| 2.2.3.1 U20S细胞的培养及传代 | 第70页 |
| 2.2.3.2 将质粒gRNA和pcDNA3.1-c-FLIP-exon5-GFP共同转染到U2OS细胞 | 第70-73页 |
| 2.2.3.3 将质粒gRNA2和Dornor DNA(a1)用德国NOZA电转仪进行转染 | 第73-74页 |
| 2.2.3.4 HEK293细胞培养 | 第74页 |
| 2.2.3.5 将质粒gRNA2和Dornor DNA(a1)共同转染到HEK293细胞 | 第74-75页 |
| 2.2.3.6 用坏死坏死抑制剂Necrostatin (40μM)提前处理ERK293细胞 | 第75-76页 |
| 2.2.3.7 用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK (20μM)提前处理ERK293细胞后 | 第76-78页 |
| 2.2.3.8 MTT检测 | 第78-80页 |
| 第三章 用CRIPR-Cas9技术在内源性cFLIP的exon8中敲入GFP | 第80-117页 |
| 3.1 实验材料 | 第80页 |
| 3.1.1 载体、菌种 | 第80页 |
| 3.1.2 实验仪器和耗材 | 第80页 |
| 3.1.3 实验试剂和药品 | 第80页 |
| 3.1.4 实验试剂的配制 | 第80页 |
| 3.2 实验内容和结果 | 第80-117页 |
| 3.2.1 Cas9载体构建 | 第80-86页 |
| 3.2.1.1 gRNA设计 | 第81页 |
| 3.2.1.2 提取pCas-Guide质粒 | 第81-82页 |
| 3.2.1.3 质粒pCas-Guide的双酶切体系 | 第82-86页 |
| 3.2.2 Donor DNA构建 | 第86-115页 |
| 3.2.2.1 融合PCR的原理 | 第86页 |
| 3.2.2.2 全基因组的提取 | 第86-87页 |
| 3.2.2.3 靶序列上半段和下半段引物设计 | 第87-88页 |
| 3.2.2.4 GFP引物设计 | 第88页 |
| 3.2.2.5 80分Donor DNA片段载体构建 | 第88-96页 |
| 3.2.2.6 扩增带有XhoI和BamHI两个酶切位点的GFP | 第96-100页 |
| 3.2.2.7 71分Donor DNA片段载体的构建 | 第100-108页 |
| 3.2.2.8 扩增带有XhoI和BamHI两个酶切位点的GFP | 第108-114页 |
| 3.2.2.9 去内毒素提取质粒 | 第114-115页 |
| 3.2.3 细胞实验 | 第115-117页 |
| 3.2.3.1 HEK293细胞培养 | 第115页 |
| 3.2.3.2 转染gRNA_(80)b和Donor DNA_(80) | 第115-117页 |
| 第四章 用CRIPR-Cas9技术构建cFLIP-exon8-GFP细胞系 | 第117-144页 |
| 4.1 实验材料 | 第117页 |
| 4.1.1 载体、菌种、酶 | 第117页 |
| 4.1.2 实验仪器和耗材 | 第117页 |
| 4.1.3 实验试剂和药品 | 第117页 |
| 4.1.4 实验试剂的配制 | 第117页 |
| 4.2 实验内容和结果 | 第117-144页 |
| 4.2.1 Cas9载体构建 | 第117-122页 |
| 4.2.1.1 gRNA设计 | 第118-119页 |
| 4.2.1.2 提取pSpCas9(BB)质粒 | 第119页 |
| 4.2.1.3 质粒pSpCas9(BB)的双酶切体系 | 第119-120页 |
| 4.2.1.4 gRNA引物的前处理 | 第120页 |
| 4.2.1.5 连接反应 | 第120页 |
| 4.2.1.6 重组载体的转化涂板 | 第120页 |
| 4.2.1.7 菌落PCR、测序保菌 | 第120-122页 |
| 4.2.4 细胞实验 | 第122-144页 |
| 4.2.4.1 通过Cruiser TM酶验证所构建的gRNA80的切割效率 | 第122-123页 |
| 4.2.4.2 通过Cruiser TM酶验证所构建的gRNA71的切割效率 | 第123-124页 |
| 4.2.4.3 HEK293细胞培养 | 第124页 |
| 4.2.4.4 转染gRNA(61-80)和c-FLIPs -exon8 (80) b-GFP扩增片段 | 第124-126页 |
| 4.2.4.5 潮霉素(hyg)筛选 | 第126页 |
| 4.2.4.6 挑单克隆 | 第126-127页 |
| 4.2.4.7 蛋白水平鉴定GFP定点敲入的稳定细胞系 | 第127-131页 |
| 4.2.4.8 基因水平鉴定GFP定点敲入的稳定细胞系 | 第131-137页 |
| 4.2.4.9 高内涵细胞成像分析 | 第137-144页 |
| 第五章 总结与讨论 | 第144-146页 |
| 参考文献 | 第146-152页 |
| 致谢 | 第152-153页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第153-154页 |
| 附录B 其他需要说明的内容 | 第154页 |
