| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 肠激酶的基因工程研究 | 第10-15页 |
| 1.1.1 肠激酶在原核体系中的表达 | 第11页 |
| 1.1.2 肠激酶在酵母体系中的表达 | 第11-14页 |
| 1.1.3 肠激酶催化特异性分析与改造 | 第14页 |
| 1.1.4 肠激酶的固定化研究 | 第14页 |
| 1.1.5 肠激酶结构及酶学特性研究 | 第14-15页 |
| 1.2 提高外源蛋白热稳定性的策略 | 第15-19页 |
| 1.2.1 蛋白体外定性进化策略 | 第16页 |
| 1.2.2 蛋白理性设计策略 | 第16-19页 |
| 1.3 本研究的设计思路及意义 | 第19-20页 |
| 第二章 牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的表达与纯化 | 第20-48页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第20页 |
| 2.1.2 工具酶、试剂盒及主要生化试剂 | 第20页 |
| 2.1.3 溶液及培养基配置 | 第20-21页 |
| 2.1.4 主要实验仪器 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-31页 |
| 2.2.1 野生型牛肠激酶轻链重组载体的构建 | 第22-23页 |
| 2.2.2 野生型菌株多拷贝子的筛选与拷贝数的鉴定 | 第23-26页 |
| 2.2.3 重组牛肠激酶轻链在毕赤酵母中表达及条件优化 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组牛肠激酶轻链的分离纯化 | 第27-29页 |
| 2.2.5 重组牛肠激酶轻链的去糖基化验证 | 第29页 |
| 2.2.6 重组牛肠激酶轻链酶活及动力学参数测定 | 第29-31页 |
| 2.3 实验结果及讨论 | 第31-47页 |
| 2.3.1 野生型牛肠激酶轻链重组载体的构建及鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.2 野生型菌株多拷贝子的筛选与基因拷贝数的鉴定 | 第32-36页 |
| 2.3.3 重组牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的表达及条件优化 | 第36-40页 |
| 2.3.4 重组牛肠激酶轻链的分离纯化 | 第40-42页 |
| 2.3.5 重组牛肠激酶轻链的去糖基化验证 | 第42-43页 |
| 2.3.6 重组牛肠激酶轻链的活性鉴定 | 第43-47页 |
| 2.4 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 牛肠激酶柔性区的预测及改造 | 第48-62页 |
| 3.1 实验材料 | 第48页 |
| 3.1.2 主要分析仪器 | 第48页 |
| 3.1.3 分析软件及服务站 | 第48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-52页 |
| 3.2.1 分子动力学模拟的应用 | 第48-49页 |
| 3.2.2 B-FITTER、Flex Service等柔性区预测软件的应用 | 第49-50页 |
| 3.2.3 同源建模软件MODELLER的应用 | 第50-51页 |
| 3.2.4 Discovery studio软件分析柔性区氢键的分布 | 第51页 |
| 3.2.5 Disulfide by design软件预测二硫键的形成 | 第51-52页 |
| 3.3 实验结果及讨论 | 第52-61页 |
| 3.3.1 牛肠激酶柔性区的预测 | 第52-56页 |
| 3.3.2 牛肠激酶柔性区的改造 | 第56-61页 |
| 3.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第四章 突变型牛肠激酶蛋白的表达与热稳定性分析 | 第62-77页 |
| 4.1 实验材料 | 第62页 |
| 4.1.1 菌株与载体 | 第62页 |
| 4.1.2 工具酶、试剂盒及主要生化试剂 | 第62页 |
| 4.1.3 溶液及培养基配置 | 第62页 |
| 4.2 实验方法 | 第62-65页 |
| 4.2.1 突变型牛肠激酶载体的构建 | 第62-64页 |
| 4.2.2 突变型牛肠激酶表达与纯化 | 第64页 |
| 4.2.3 野生型与突变型牛肠激酶动力学稳定性测定 | 第64-65页 |
| 4.2.4 野生型与突变型牛肠激酶动力学参数测定 | 第65页 |
| 4.2.5 野生型与突变型蛋白二级结构的测定 | 第65页 |
| 4.3 实验结果及讨论 | 第65-76页 |
| 4.3.1 突变型牛肠激酶载体的构建及鉴定 | 第65-66页 |
| 4.3.2 野生型与突变型牛肠激酶动力学稳定性比较 | 第66-70页 |
| 4.3.3 突变体酶动力学常数的测定 | 第70-71页 |
| 4.3.4 突变型牛肠激酶二级结构的比较 | 第71-72页 |
| 4.3.5 突变型牛肠激酶分子水平的构象变化 | 第72-76页 |
| 4.4 本章小结 | 第76-77页 |
| 第五章 结论与展望 | 第77-79页 |
| 5.1 主要结论 | 第77-78页 |
| 5.2 展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 发表论文及参加科研情况 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
